[發(fā)明專利]在植物中表達(dá)蛋白質(zhì)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210488322.6
• 申請日: 2006-05-02
• 公開（公告）號: CN103031310B
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 安娜－莉澤·威廉森;愛德華·彼德·雷比茨基;詹姆斯·馬爾科姆·麥克萊恩;因加·伊莎貝爾·貝克爾－希策爾奧特
• 申請（專利權(quán)）人: 開普敦大學(xué)
• 主分類號: C12N15/44
• 分類號: C12N15/44;C12N15/82;C07K14/11;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 張瑩

本發(fā)明涉及在植物中表達(dá)蛋白質(zhì)，具體涉及在植物中生產(chǎn)流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步驟：將流感H5基因或編碼其功能等價(jià)物的核酸克隆到適于靶向植物中存在的組分的載體中，用所述載體侵入植物的至少一部分，或者用所述載體轉(zhuǎn)化植物組織，以瞬時(shí)表達(dá)所述流感病毒H5多肽和/或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物；和回收由所述植物表達(dá)的流感病毒H5多肽。本發(fā)明還涉及在所述方法中使用的或者作為所述方法的結(jié)果產(chǎn)生的載體、轉(zhuǎn)基因植物或其部分和這樣的植物的子代。

本發(fā)明是國際申請?zhí)朠CT/ZA2006/000063，國際申請日為2006年5月2日，進(jìn)入中國國家階段日期為2007年10月26日，中國國家申請?zhí)枮?00680014202.5，發(fā)明名稱為“在植物中表達(dá)蛋白質(zhì)”的分案申請。

發(fā)明背景

本發(fā)明涉及在植物中表達(dá)蛋白。特別地，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因蛋白表達(dá)和高產(chǎn)量蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞內(nèi)定位的方法。本發(fā)明還涉及在植物中生產(chǎn)人乳頭瘤病毒(HPV)蛋白和/或流感病毒H5蛋白。本發(fā)明還涉及評估蛋白在植物內(nèi)表達(dá)的快速機(jī)制。

應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行異源蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)正逐漸獲得廣泛的接受，并且可能成為疫苗蛋白節(jié)約成本生產(chǎn)的平臺。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物研究一大類蛋白和/或表達(dá)載體的表達(dá)特征并不總是可行的，原因在于這一程序費(fèi)時(shí)的本質(zhì)。相反，瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)能夠快速評估各種不同的蛋白在各種植物物種中的蛋白表達(dá)。

關(guān)于應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行大規(guī)模蛋白生產(chǎn)的另一個(gè)問題通常是生產(chǎn)的異源蛋白的令人失望的低水平。植物質(zhì)體，特別是葉綠體，已經(jīng)成功地被表達(dá)異源蛋白的重組載體轉(zhuǎn)化，以顯著地增加植物中由每份總可溶蛋白所產(chǎn)生的蛋白水平(參見，例如，WO2005/011367和WO2004/005467A2)。質(zhì)體還能夠輸入各種分子，包括蛋白。存在不同的方法，通過這些方法發(fā)生分子輸入，一個(gè)這樣的方法涉及與質(zhì)體的類囊體膜相互作用。異源蛋白靶向質(zhì)體是一種顯著增加蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的積聚的機(jī)制。

許多年來一直應(yīng)用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移來產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化植物。這種方法包括將T-復(fù)合物(一種由農(nóng)桿菌T-DNA和毒力基因產(chǎn)物形成的復(fù)合物)從農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞(Zupan等.，2000)。將位于限定單鏈T-DNA的25bp同向重復(fù)序列(左和右邊界)之間的任何DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞核中(Zupan等.，2000)，在這里它通過不正常重組而整合到植物染色體上(Somers和Makarevitch，2004)。在所述核內(nèi)存在的許多T-DNA拷貝沒有結(jié)合，但是得到轉(zhuǎn)錄，這引起瞬時(shí)表達(dá)。瞬時(shí)表達(dá)不受位置效應(yīng)的影響，并且可以產(chǎn)生比穩(wěn)定轉(zhuǎn)化顯著更高的外源蛋白水平(Kapila等.，1997)。

通常應(yīng)用兩種農(nóng)桿菌侵入(農(nóng)桿菌侵入法)方法：注射和真空侵入。農(nóng)桿菌注射包括直接注射到葉片的遠(yuǎn)軸氣室，而葉片仍然附著在植物上(Voinnet等.，2003)。在真空侵入過程中，對農(nóng)桿菌混懸液應(yīng)用真空，葉片浸沒在所述混懸液中(Kapila等.，1997)。盡管通常只在少數(shù)葉片上進(jìn)行，但是這一技術(shù)可以規(guī)模化：Medicago Inc.(Quebec，Canada)的研究者每周能夠進(jìn)行農(nóng)桿菌侵入多達(dá)7500片苜蓿葉片，并且Stefan Schillberg及同事(Institute for Molecular Biotechnology，RWTH Aachen，Germany)已經(jīng)進(jìn)行了農(nóng)桿菌侵入了多達(dá)100kg的煙草葉片(Twyman 2004)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)在侵入后60到72小時(shí)達(dá)到最大，然后由于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)而迅速下降(Voinnet等.，2003)。PTGS或RNA干擾是一種適應(yīng)性抗病毒抵御反應(yīng)，其限制病毒在植物中的復(fù)制和傳播。這一過程包括在胞質(zhì)中識別靶點(diǎn)RNA和起始序列-特異性RNA降解途徑(Voinnet，2001)。某些植物病毒編碼具有抑制PTGS能力的沉默阻抑制子。這些沉默抑制蛋白中的一些，諸如番茄斑萎病毒(TSWV)的NSs(Takeda等，2002)，和番茄叢矮病毒的p19(Voinnet等.，2003)已經(jīng)用來延長和擴(kuò)增農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)，其通過包含沉默抑制基因的農(nóng)桿菌的共同侵入而進(jìn)行。