[發(fā)明專利]基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法和裝置

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210488037.4
• 申請日: 2012-11-26
• 公開（公告）號: CN103048299A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 匡翠方;郝翔;李帥;顧兆泰;王軼凡
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及顯微成像領(lǐng)域，尤其涉及一種基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法及裝置。

背景技術(shù)

與絕大部分光學(xué)成像一樣，自從顯微鏡被發(fā)明以來，阿貝衍射極限也一直制約著顯微系統(tǒng)分辨率的提高。早期的顯微系統(tǒng)均為寬場成像系統(tǒng)，成像分辨能力有限。這一情況直到共聚焦顯微系統(tǒng)(Confocal?Microscope)發(fā)明后才得到一定的改善。共聚焦顯微的基本概念在1957年由M.Minsky等人提出(參見M.Minsky等Microscopy?Apparatus，美國專利3013467)，但直到1978年該技術(shù)才真正得以儀器化(參見C.Cremer等Considerationson?a?laser-scanning-microscope?with?high?resolution?and?depth?of?field，MicroscopiaActa?81，31-44(1978))。與傳統(tǒng)的寬場顯微系統(tǒng)相比，共聚焦顯微系統(tǒng)采用掃描成像的方式，在與成像物面共軛的焦平面上放置一個(gè)針孔(Pinhole)對非成像點(diǎn)周圍的雜散光進(jìn)行遮擋，從而有效地限制了系統(tǒng)的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。通過系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)分析可以證明，使用共聚焦方法，能夠在系統(tǒng)的極限分辨率提高約1.4倍。

近年來，隨著受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)(Stimulated?Emission?Depletion(STED)microscopy)的提出(參見S.W.Hell等Breaking?the?DiffractionResolution?Limit?by?Stimulated-Emission-Stimulated-Emission-DepletionFluorescence?Microscopy，Optics?Letters?19，780-782(1994))，遠(yuǎn)場光學(xué)顯微成像的分辨率得到更大的改進(jìn)，其分辨率被進(jìn)一步推進(jìn)達(dá)到納米量級，可以在活細(xì)胞上看到納米尺度的蛋白質(zhì)，從而從物理上打破了衍射光學(xué)極限。其具體原理是：基于傳統(tǒng)共焦顯微技術(shù)，對熒光標(biāo)記進(jìn)行熒光激發(fā)，與此同時(shí)用另一束高強(qiáng)度同軸激光光束形成空心聚焦暗斑，對熒光標(biāo)記周圍的衍射彌散發(fā)光進(jìn)行抑制，這樣只有中心點(diǎn)的熒光激發(fā)現(xiàn)象可以被觀察到，從而打破衍射極限，達(dá)到超分辨顯微成像的目的。

雖然STED顯微技術(shù)有效地提高了光學(xué)熒光顯微系統(tǒng)的成像分辨能力，但是由于其理論本身的限制，要求抑制光束的輸入光功率很高(通常達(dá)到W量級)，加大了熒光漂白和光毒作用的風(fēng)險(xiǎn)，容易對熒光樣品造成不可逆的損害，誤導(dǎo)觀察現(xiàn)象。為了降低抑制光束的光功率，Vicidomini等人在2011年提出了基于時(shí)間門技術(shù)的STED顯微術(shù)(time-gated?STED，g-STED)(參見G.Vicidomini等Sharper?low-power?STED?nanoscopy?by?timegating，Nature?Methods?8，571-573(2011))。該技術(shù)利用抑制光束照射熒光樣品在抑制其受激熒光幅射的同時(shí)會縮短其熒光壽命的特點(diǎn)，在系統(tǒng)中設(shè)置時(shí)間門對熒光信號進(jìn)行實(shí)時(shí)過濾，從而有效地將所需要的抑制光束輸入光功率降低到數(shù)十mW量級。但是，該種方法減少了可有效利用的熒光信號強(qiáng)度，降低了系統(tǒng)信噪比，容易對系統(tǒng)的實(shí)際分辨能力產(chǎn)生不利影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法和裝置，在保證低抑制光束輸入光功率的同時(shí)，提高系統(tǒng)的信噪比，從而提高系統(tǒng)的實(shí)際分辨能力。

一種基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法，包括以下步驟：

1)將圓偏振光作為激發(fā)光束，使用經(jīng)渦旋位相編碼的圓偏振光作為抑制光束，所述激發(fā)光束通過大數(shù)值孔徑顯微物鏡聚焦形成實(shí)心聚焦光斑，所述抑制光束通過所述大數(shù)值孔徑顯微物鏡聚焦形成空心聚焦光斑，兩光斑同時(shí)對熒光樣品進(jìn)行掃描；

2)利用所述大數(shù)值孔徑顯微物鏡收集掃描熒光樣品發(fā)出的熒光，并通過光電感應(yīng)器件得到整幅熒光強(qiáng)度圖像；

3)通過分析所述熒光強(qiáng)度圖像的熒光強(qiáng)度信息，得到相應(yīng)的熒光壽命信息；

4)設(shè)置時(shí)間門，對所述熒光壽命信息中的長壽命熒光圖像和短壽命熒光圖像進(jìn)行分離；

5)設(shè)置權(quán)值，用所述的短壽命熒光圖像減去加權(quán)的長壽命熒光圖像，得到最終的超分辨顯微圖像。

步驟1)中所述的渦旋位相編碼是指對于一個(gè)橫截面中心對稱的圓形入射光束，以光束中心點(diǎn)為圓心，對橫截面內(nèi)的光束產(chǎn)生0～2π的渦旋位相延遲，位相延遲量僅與截面內(nèi)特定點(diǎn)的角向大小有關(guān)，而與該點(diǎn)到圓心的距離無關(guān)。可用如下公式加以表示：

其中Δα為位相延遲量，為角向大小。