[發(fā)明專(zhuān)利]一種發(fā)酵液中提取硫酸軟骨素的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210487801.6
• 申請(qǐng)日: 2012-11-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102965414A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉立明;劉佳;吳秋林;陳堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P19/26
• 分類(lèi)號(hào): C12P19/26;C08B37/08;C12R1/125
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

一種發(fā)酵液中提取硫酸軟骨素的方法，屬于生物工程領(lǐng)域，特別是從發(fā)酵液中而非動(dòng)物中提取硫酸軟骨素。

背景技術(shù)

硫酸軟骨素(chondroitin?sulfate，CS)是一種酸性的黏多糖，其二糖單體由葡糖醛酸(D-GlcUA)與N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1，3鍵相連，糖鏈生成后由磺基轉(zhuǎn)移酶在GalNAc的碳4位或碳6位進(jìn)行硫酸化，如圖1。根據(jù)其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)差異可分為A、B、C、D、E、F、H等多種，通常從哺乳動(dòng)物組織中提取得到的硫酸軟骨素以CS-A、CS-C為主。

CS是一類(lèi)重要的生物高分子，具有廣泛的生物活性，其作為安全有效的保健食品和藥品在世界各國(guó)得到了廣泛應(yīng)用。硫酸軟骨素具有以下生物活性：鎮(zhèn)痛抗炎作用；促進(jìn)成骨細(xì)胞增生，誘導(dǎo)新骨形成；抗腫瘤作用；抗粘連作用；免疫調(diào)節(jié)作用；調(diào)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用；抗氧化、清除自由基和廷緩衰老的作用。CS還具有抗炎、抗病毒、抗過(guò)敏和加速傷口愈合的作用，如抗HIV活性。在歐、美、日等發(fā)達(dá)國(guó)家，硫酸軟骨素作為保健品長(zhǎng)期應(yīng)用于防治冠心病、心絞痛、心肌梗塞、冠狀動(dòng)脈機(jī)能不全、心肌缺血等疾病，無(wú)明顯的毒副作用，能顯著降低冠心病患者的發(fā)病率和死亡率。

現(xiàn)今硫酸軟骨素工業(yè)生產(chǎn)方法是從豬、牛、雞、鯊魚(yú)等動(dòng)物軟骨中提取，主要使用酶法和堿法相結(jié)合的方法，但是該方法存在收集原料的成本高、質(zhì)量不穩(wěn)定、純度不好控制、提取復(fù)雜、生產(chǎn)造成污染等諸多問(wèn)題。發(fā)酵法生產(chǎn)CS不受原材料限制，成本低、環(huán)境友好，但是尚處于初級(jí)階段，國(guó)內(nèi)使用發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素尚屬空白，國(guó)外有發(fā)酵液中小量制備硫酸軟骨素類(lèi)似物的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵液中提取硫酸軟骨的方法，該提取方法具有回收率高、提取簡(jiǎn)單、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

1、發(fā)酵液的制備

取0.1mL篩選的枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtillis?BN)接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃，裝液量50mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)12h后按照10％接種量接種于7L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵，培養(yǎng)溫度為37℃，裝液量為3L/7L，轉(zhuǎn)速為400rpm，通氣量為1.7L/min，發(fā)酵周期為24h。

菌種：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtillis?BN)是由本研究室選育，主要用來(lái)生產(chǎn)硫酸軟骨素，該菌株已申請(qǐng)中國(guó)專(zhuān)利，并且進(jìn)入實(shí)質(zhì)性審查，申請(qǐng)?zhí)枮?01110127831.1。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K₂HPO₄·3H₂O?0.04％，KH₂PO₄0.04％。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2％，酵母粉5％，(NH₄)₂SO₄0.2％，K₂HPO₄0.15％，KH₂PO₄·3H₂O0.15％，MgSO₄·7H₂O?0.04％，MnCl₂·4H₂O?0.02％。

2、發(fā)酵液中樣品分離純化

1)取發(fā)酵液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45℃進(jìn)行濃縮，將發(fā)酵液體積濃縮至原來(lái)的三分之。用三氯乙酸調(diào)pH至4.5，常溫下靜置1h，用5mol/L的NaOH調(diào)pH至6.0，8000rpm離心15min除去菌體；

2)取上清液，加入上清體積2-3倍的乙醇，機(jī)械攪拌1h后低溫靜置24h。傾去部分上清，殘余液在4000rpm下離心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解，加入0.7-1倍體積的氯仿，攪拌1h后靜置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清體積2-3倍的無(wú)水乙醇，攪拌30min，靜置24h虹吸部分上清液，殘余液離心20min，收集沉淀，重復(fù)上述過(guò)程2次；

3)加入0.3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速攪拌12h，6000rpm離心20min，收集上清液再次加入上清體積2-3倍的無(wú)水乙醇，攪拌30min，靜置24h，將提純樣品溶于適量去離子水中；