[發明專利]富集重鎘的基因工程菌及其構建和應用

在審

• 申請號: 201210486611.2
• 申請日: 2012-11-26
• 公開（公告）號: CN102925404A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 鄭濤;劉偉;陳怡露;陳璞;雍曉雨;周俊
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/52;C12N15/63;B09C1/10;C12R1/40
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及鎘富集基因工程菌及其構建方法和應用，具體是指鎘富集基因工程菌構建及其構建得到的一株菌株，還涉及該菌株的鎘耐受和鎘吸收等功能的表征。

背景技術

由工農業生產活動產生的大量重金屬對人類和生態環境造成了非常嚴峻的危害,?例如Cd、Hg、As、Pb等，可以代替Zn、Fe、Cu以及其它的一些非重金屬元素，破壞它們作為一些蛋白和酶的輔因子作用，從而干擾生物體的正常生理代謝活動。而且大部分重金屬可以長期停留在環境土壤中，用傳統的物理化學方法修復，包括利用化學試劑提取、電化學、就地掩埋等等，往往代價過高、效率低下，甚至會改變土壤的物理和化學結構，大大降低土壤肥力。

近年來，以基因工程菌為基礎的生物修復方式以其經濟性和有效性等優勢，正得到越來越多的重視。惡臭假單胞菌（Pseudomonas?putida）是具有很強抗逆性能的一株環境優勢菌株，能夠降解環境中的多種有機污染物，如甲苯，并具有一定的重金屬（如Cu和Cd）耐受能力等。惡臭假單胞菌KT2440(Pseudomonas?putida?KT2440)?是一株模式環境微生物菌株，也是迄今遺傳研究闡述得最為清晰、代謝多樣性研究得最為透徹的腐生假單胞菌，且作為根際促生菌，可以與植物配合作用，增強植物在環境脅迫尤其是重金屬污染中的生存能力。惡臭假單胞菌KT2440基因組在2002年被解析，是第一個被解析的惡臭假單胞菌菌株。由于其遺傳操作系統簡單清晰，是首選的基因克隆、表達的革蘭氏陰性菌株之一。

目前利用微生物修復治理土壤中的重金屬污染土壤的機理包括通過菌體分泌的有機酸和氨基酸的溶解作用、微生物對重金屬的生物轉化作用等。而來源于裂殖酵母、低等藻類和大部分植物的植物螯合肽合成酶，在重金屬離子的誘導下，可以催化低分子量的谷胱甘肽（GSH）并通過轉肽反應生成相對高分子量的植物螯合肽（γ-Glu-Cys）n-Gly（n=2-11），后者是具有更強金屬螯合能力的非蛋白巰基（NPT）多肽。研究表明，通過在E.coli中異源表達粟酒裂酵母（Schizosaccharomyces?pombe）SpPCS基因和小麥AtPCS基因可以明顯增強工程菌的耐Cd能力，并可以提高菌體中Cd的累積量（分別達到14.9?μmol/g[dry?weight]?和7.2?μmol/g[dry?weight]）。

發明內容

本發明的第一個技術目的在于提供了一株新的可以富集重金屬鎘的惡臭假單胞菌基因工程菌；使得本發明得到的基因工程菌株具有可以作為植物促生菌，可與植物配合協同修復重金屬污染土壤的潛力。

本發明的第二個技術目的在于提供上述基因工程菌株的構建方法，該構建方法是一種在惡臭假單胞菌KT2440中異源表達粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces?pombe）植物螯合肽合成酶基因SpPCS?的基因工程方法。

本發明的第三個技術目的在于上述基因工程菌株在配合植物協同修復土壤重金屬污染中的應用。

為實現本發明的技術目的，本發明采用以下技術方案。

一、采用本發明所述的構建方法得到的一株富集重鎘的基因工程菌，其分類命名為惡臭假單胞菌（Pseudomonas?putida）KT2440-SpPCS，其保藏編號為：CCTCC?NO：M?2012435。

二、本發明所述的可惡臭假單胞菌（Pseudomonas?putida）KT2440-SpPCS的構建方法：以環境模式菌株惡臭假單胞菌（Pseudomonas?putida）KT2440為出發菌，重組表達粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces?pombe）基因SpPCS，獲得可以富集重金屬鎘的目標基因工程菌。

具體步驟如下：

1）以粟酒裂殖酵母基因組DNA為模板，PCR擴增出SpPCS基因，經T-A克隆連接到測序載體PMD19-T?Simple質粒，挑正確的轉化子，經測序，比對正確，得到包含表達基因SpPCS的中間質粒PMD19-T-SpPCS；?

2）設計酶切位點將SpPCS插入到表達質粒pBBR1MCS-5載體的相應的酶切位點之間、連接獲得重組質粒pBBR1MCS-5-SpPCS；