[發明專利]高效克隆篩選表達載體、其制備方法及用途有效
| 申請號： | 201210483844.7 | 申請日： | 2012-11-23 |
| 公開（公告）號： | CN103834686A | 公開（公告）日： | 2014-06-04 |
| 發明（設計）人： | 樓莊偉;孔云華;梅佳;賈園;陳侃;宋云鵬;呂強 | 申請（專利權）人： | 上海藥明康德新藥開發有限公司;蘇州藥明康德新藥開發有限公司;無錫藥明康德生物技術有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/64 |
| 代理公司： | 上海浦一知識產權代理有限公司 31211 | 代理人： | 劉昌榮 |
| 地址： | 200131 上海市浦東*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 高效 克隆 篩選 表達 載體 制備 方法 用途 | ||
1.一種高效克隆篩選表達載體，其特征在于，該載體由piggyBac轉座系統的ITRs序列插入到哺乳動物表達載體中得到。
2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述哺乳動物表達載體為pcDNA3.1(+)。
3.根據權利要求2所述的載體，其特征在于，該載體具有如SEQ?ID?No:3所示的序列。
4.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述哺乳動物表達載體為pcDNA4/TO。
5.根據權利要求4所述的載體，其特征在于，該載體具有如SEQ?ID?No:4所示的序列。
6.權利要求1至5任一項所述載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
1）以pGH為克隆載體，全基因合成5’ITR和3’ITR?DNA片段，片段的兩頭加入EcoRV的酶切位點，得到載體pGH-ITR5和pGH-ITR3；
2）以pGH為克隆載體，全基因合成GeneBank序列號為EF587698的轉錄酶基因片段，且片段的兩頭分別加入EcoRI和HindIII的酶切位點，得到載體pGH-Transposase；
3）用EcoRV酶切載體pGH-ITR5和pGH-ITR3，EcoRI和HindIII酶切載體pGH-Transposase；
4）NruI酶切哺乳動物表達載體，同時EcoRI和HindIII酶切表達載體pTriEx2；
5）將片段ITR5連接到經過NruI酶切的哺乳動物表達載體，得到含ITR5片段的表達載體；
6）同時將片段Transposase連接到經過EcoRI和HindIII酶切的表達載體pTriEx2，得到新表達載體pTriEx2-Transposase；
7）Bstz17I酶切步驟5）得到的含ITR5片段的表達載體；
8）將片段ITR3連接到步驟7）得到的表達載體。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物表達載體包括pcDNA3.1(+)或pcDNA4/TO。
8.權利要求1至5任一項所述載體在篩選表達目的蛋白克隆中的應用。
9.權利要求1至5任一項所述載體在轉染哺乳動物細胞中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述哺乳動物細胞包括人胚腎細胞HEK293或人宮頸癌細胞Hela。
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