[發(fā)明專利]檢測可溶性白細胞分化抗原40配體的試劑盒及多肽配體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210483295.3
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN102964428A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設計）人: 段旭;焦守恕;李全
• 申請（專利權(quán)）人: 同昕生物技術（北京）有限公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發(fā)明涉及生物檢測領域，尤其涉及檢測可溶性白細胞分化抗原40配體的試劑盒及多肽配體。

背景技術

近年研究提示炎癥與免疫在動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，提示動脈粥樣硬化可能是一種慢性炎癥性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，白細胞分化抗原40（CD40）信號通路參與了動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)主要細胞成分（血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞以及巨噬細胞）的炎癥反應的調(diào)節(jié)，參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。存在于動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的細胞通過CD40-CD40配體相互作用，導致自身活化，表達和分泌有利于免疫應答發(fā)生、炎癥反應、血凝和血栓形成的蛋白質(zhì)細胞因子，而最終導致粥樣硬化斑塊病變的惡化。CD40配體（CD40L）可激活在動脈粥樣硬化斑塊中的關鍵性細胞成分，如黏附分子、細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、組織因子等的產(chǎn)生，導致斑塊的不穩(wěn)定和破裂。在AS的免疫反應調(diào)節(jié)中CD40-CD40配體的相互作用非常重要，它們的相互作用顯著影響AS相關細胞的功能，并且與斑塊的發(fā)生發(fā)展密切相關。

CD40L也稱Pg39、CD154，由261個氨基酸組成的Ⅱ型跨膜蛋白，其三維結(jié)構(gòu)類似于腫瘤壞死因子α（TNF-α），屬于TNF家族細胞因子。主要表達于活化的CD4⁺T細胞表面。近年發(fā)現(xiàn)，除了T細胞，CD40L還表達于B細胞、自然殺傷細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞以及非造血系統(tǒng)起源的內(nèi)皮細胞等。血小板在激活中表達CD40L，并在激活后數(shù)分鐘至數(shù)小時降解為可溶性白細胞分化抗原40配體（sCD40L）。sCD40L可通過促進血小板-單核細胞聚集和產(chǎn)生活性氧自由基維持炎癥反應，其在動脈粥樣斑塊形成過程中的作用目前已經(jīng)在研究中證實，急性冠狀動脈綜合癥（ACS）病人的sCD40L值較正常人又明顯升高，這預示著sCD40L水平對ACS臨床診斷及病情監(jiān)測具有一定意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種多肽配體。

本發(fā)明所提供的多肽配體，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測可溶性白細胞分化抗原40配體的試劑盒。

本發(fā)明所提供的檢測可溶性白細胞分化抗原40配體的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包含所述的多肽配體。

所述試劑盒還包括辣根過氧化物酶標記的sCD40L單克隆抗體。

所述試劑盒還包括已知濃度的重組全長CD40L抗原稀釋液作為標準品。

所述試劑盒還包括魯米諾作為化學發(fā)光體系的底物，對碘苯酚作為發(fā)光增強劑。

本發(fā)明的又一個目的是提供一種檢測可溶性白細胞分化抗原40配體的試劑盒的制備方法。

本發(fā)明所提供的檢測可溶性白細胞分化抗原40配體的試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

將所述多肽配體按終濃度0.5μg/ml、1.0μg/ml或2.0μg/ml加入到20mmol?pH4.0醋酸鹽緩沖液或20mmol?pH7.4磷酸鹽緩沖液或50mmol?pH9.6碳酸鹽緩沖液中混勻后，加入化學發(fā)光板內(nèi)，每孔100μl，4℃溫浴16-22小時，棄去孔內(nèi)液體后加入含有牛血清白蛋白或胎牛血清的20mmol?pH7.4的磷酸鹽緩沖液120μl，37℃下靜置2小時后，棄去孔內(nèi)液體，干燥發(fā)光板，得到包被多肽配體的板條。

所述方法還包括以下步驟：將sCD40L單克隆抗體用辣根過氧化物酶標記。

所述方法還包括以下步驟：將重組全長CD40L抗原用蛋白穩(wěn)定劑稀釋成6個梯度濃度，分別為0ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml和20.0ng/ml。

所述方法還包括以下步驟：制備化學發(fā)光底物液A液和B液：

用超純水中配制0.1mol/L?pH8.2-8.7的Tris-HCl緩沖液，加入終濃度為3mmol/L的魯米諾、0.3mmol/L的Tween20和碘苯酚混合溶液，作為A液；

用超純水配制的0.1mol/L?pH4.4-4.8的檸檬酸緩沖液，加入終濃度為30%的H₂O₂溶液，作為B液。

所述多肽配體在制備檢測可溶性白細胞分化抗原40配體的試劑盒中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述檢測可溶性白細胞分化抗原40配體的試劑盒的檢測方法如下：

（1）自2-8℃冰箱中取出所述試劑盒，室溫平衡30分鐘。

（2）取出包被板條，插入發(fā)光板架上。