[發明專利]蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因擴增引物、設計和擴增方法

有效

• 申請號: 201210482530.5
• 申請日: 2012-11-22
• 公開（公告）號: CN103074335A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 徐田軍;王日昕;金逍逍;孫悅娜
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

技術領域

本發明屬于魚類線粒體基因組研究領域，具體涉及一種高效擴增多種蝦虎魚類線粒體細胞色素c(Cytc)氧化酶亞基Ⅲ（cytochrome?c?oxidase?subunit?Ⅲ；COⅢ）基因大部分序列及NADH還原酶復合體亞基3（NADH?dehydrogenase?subunits?3；ND3）基因全序列的擴增引物及其設計和擴增方法。

背景技術

魚類線粒體基因組由13個編碼蛋白質基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因（12S?rRNA及16S?rRNA）共37個編碼基因及一段主要的非編碼區（控制區）組成，具有結構簡單、拷貝數多、嚴格的母系遺傳、幾乎不發生重組、編碼效率高、進化速度快且不同區域進化速度存在差異等特點。由于魚類線粒體基因組所具有的這些特點，使其成為魚類分子群體遺傳學、系統發生學及保護生物學等研究領域的重要分子標記。

蝦虎魚類隸屬于鱸形目、蝦虎魚亞目，是世界上種類最多，分布最廣的魚類之一。估計全世界的蝦虎魚種類有2000多種，它們形成一個龐大的生物類群，在水環境尤其是海洋生態環境中占有重要的地位。蝦虎魚多為肉食性的小型魚類，遍布全世界，尤以熱帶為多，主要為海水魚類，大部分營底棲生活，主要特征是其腹鰭愈合成一吸盤狀。近年來，由于過度捕撈、氣候環境變化等原因，許多傳統的經濟魚種資源已經形不成漁訊，有些甚至枯竭，但蝦虎魚類因其適應能力強、生命周期短、繁殖力強等原因，資源量卻逐年增加。大部分蝦虎魚類經濟價值不高，國內外有關于蝦虎魚類的研究相對較少，因其種類繁多，外部形態特征極為相似，導致不易鑒別和認定。目前，蝦虎魚類的分類還不甚清晰，很多種類的分類地位還比較混亂。

線粒體全基因組及線粒體基因組上的相關基因作為分子標記已被廣泛地用于蝦虎魚群體遺傳學、系統發生學及保護生物學等研究領域。COⅢ及ND3作為脊椎動物線粒體蛋白質編碼基因中3個編碼細胞色素c(Cytc)氧化酶亞基及7個編碼NADH還原酶復合體亞基的基因之一，其所含的系統發育信息位于13個編碼蛋白基因中的中上等，可應用于脊椎動物的系統進化和分類研究。然而未曾有報道過擴增線粒體COⅢ及ND3基因序列的通用引物，尤其是針對蝦虎魚類。因此設計特異性擴增蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因序列的通用引物，從而為高效獲得蝦虎魚線粒體COⅢ及ND3基因序列及線粒體基因組全序列奠定基礎。

發明內容

針對上述現有技術存在的空缺，本發明旨在提供一對可高效特異擴增多種蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因序列的單鏈寡核苷酸引物，從而為快速有效獲取蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因序列以進行系統進化和分類研究提供一個有力工具。本發明的目的還在于提供所述蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因擴增引物的設計方法，以及利用所述的蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因擴增引物對蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因進行擴增的方法。

為實現本發明的發明目的，發明人提供如下技術方案：

蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因擴增引物，由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQ?ID?No.2所示的核苷酸序列。

本發明的輕鏈引物Gobies-COⅢ-ND3-F（SEQ?ID?No.1所示）有21個堿基：ATACCACATAGTAGACCCCAG，位于COⅢ基因上；重鏈引物Gobies-COⅢ-ND3-R?（SEQ?ID?No.2所示）有21個堿基：GACTTTAACCACGAGCTTTTG，位于tRNA-Arg基因上。

本發明所述的蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因擴增引物對在東海海域采集的17種蝦虎魚類，均能獲得片段長度為1150?bp左右的特異性擴增產物，經測序及與GenBank中同源序列的比較，確認為包含線粒體ND3基因全序列、tRNA-Gly基因全序列、及長度為720?bp左右的COⅢ基因絕大部分序列的擴增產物，體現出本發明較廣的擴增范圍與較強的擴增能力，從而為快速有效獲取蝦虎魚類線粒COⅢ及ND3基因序列以進行系統進化及分類研究提供一個有力工具。

作為優選，根據本發明所述的蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因擴增引物，其中所述的蝦虎魚類包括但不限于下述：中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、臺灣溝蝦虎魚、睛尾蝌蚪蝦虎魚。