[發明專利]一種細胞共養的方法

無效

• 申請號: 201210481063.4
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN103834612A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 王英俊;郝智慧;張浩
• 申請（專利權）人: 青島康地恩動物藥業有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/077
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種細胞共養的方法，有助于醫學和生物學方面今后對細胞間相互關系的研究。

背景技術

細胞是組成有機體的形態和功能的基本單位，自身又是由許多部分構成的。關于結構的研究不僅要知道它是由哪些部分構成的，而且要進一步搞清每個部分的組成。相應地，關于功能不僅要知道細胞作為一個整體的功能，而且要了解各個部分在功能上的相互關系。有機體的生理功能和一切生命現象都是以細胞為基礎表達的。因此，不論對有機體的遺傳、發育以及生理機能的了解，還是對于作為醫療基礎的病理學、藥理學等以及農業的育種等，細胞學都至關重要。

對于研究細胞起了巨大推動作用的是M.J.施萊登和T.A.H.施萬。前者在1838年描述了細胞是在一種粘液狀的母質中經過一種像是結晶樣的過程產生的，而且首先產生出核（還發現核仁）。他并且把植物看作細胞的共同體，就好像水螅蟲的群體一樣。在他的啟發下施萬堅信動、植物都是由細胞構成的。他積累了大量事實，指出二者在結構和生長中的一致性，于1839年提出了細胞學說。與此同時，捷克動物生理學家J.E.浦肯野提出原生質的概念;德國動物學家C.T.E.von西博爾德（1845）斷定原生動物都是單細胞的。德國病理學家R.C.菲爾肖(1855)在研究結締組織的基礎上提出“一切細胞來自細胞”的名言，并且創立了細胞病理學。德國動物學家M.舒爾策在1861年對細胞下了定義：“細胞是一團具有一切生命特征的原生質，細胞核處于其中。”

細胞間相互關系是當今醫學和生物學研究的一個重要方向。要進行這方面的研究往往離不開細胞培養，特別是細胞共培養(coculture)?。我們介紹一種簡單易行的細胞共培養方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種細胞共養的方法，通過細胞共培養的手段觀察兩種不同類型細胞之間的相互作用，有效提高藥物的生物利用度，延緩藥物的釋放，增強藥效，降低毒副作用，達到緩釋、長效、靶向的目的。所介紹的細胞共培養方法，其特點為：（1）簡單易行，在一般實驗室即可進行；（2）在共培養過程中可以清楚地觀察到2種細胞的生長情況，便于拍照等觀察，不象微孔底膜套皿不易觀察細胞生長情況；（3）在細胞接種時，玻片大小一樣，玻片上的細胞數可由每孔總的細胞數減去每孔剩余的細胞數而得，只要在實驗前試驗幾次即可得到；（4）共培養的是貼壁細胞，細胞不易交叉污染；（5）通過在篩網上再固定蓋玻片的方法還可觀察3種貼壁細胞的共培養情況；（6）實驗結束后可在玻片上進行掃描電鏡、免疫組化等研究。

具體實施方式

（1）共培養的準備，蓋玻片、24孔板、不銹鋼篩網；

（2）細胞單獨培養，從組織中取細胞樣品分離鑒定培養；

（3）細胞共同培養實驗，取單獨培養好的細胞計數后接種于24孔板中，加入血清培養液，培養24小時，細胞快呈融合生長狀態時，更換小牛血清的DMEM，每孔加入慶大霉素24小時后進行共培養。

實施例1

（1）共培養的準備：:蓋玻片用玻璃刀裁成剛好能放入24孔板的正方形，按細胞培養用品要求清洗后消毒備用，不銹鋼篩網用剪刀剪成正方形，再把篩網的鋼絲彎成垂直于網面的支腳，大小以能放入24孔板孔為宜，使上下二層細胞相差1mm，清洗后消毒備用。

（2）細胞單獨培養:大鼠腎間質成纖維細胞和大鼠腎小管上皮細胞的培養與鑒定按文獻報道進行，培養成功后進行下列實驗，以觀察上述裝置培養細胞的可行性，實驗前大鼠腎小管上皮細胞和大鼠腎間質成纖維細胞均作錐蟲藍(0.4?%)?染色，檢測細胞的活性狀態。

（3）?細胞共同培養實驗:將原代培養的大鼠腎小管上皮細胞消化后計數，按每孔1×10⁵個細胞接種于預先放有備用蓋玻片的24孔板中，以含10%小牛血清的DMEM培養液培養24小時，細胞快呈融合生長狀態時，更換培養液為含1%小牛血清的DMEM，每孔加入200μg/ml慶大霉素24小時后進行共培養。取第3代的大鼠腎間質成纖維細胞，按每孔1×10⁵細胞數植入24孔板內以含10%小牛血清的DMEM培養液培養12小時，細胞貼壁生長后，將培養液更換為含1%小牛血清的DMEM繼續培養24小時，放入備用不銹鋼篩網，再放入上述長有大鼠腎小管上皮細胞的蓋玻片，共培養48小時后，去蓋玻片及不銹鋼篩網，用四甲基偶氮多胍(MTT)?摻入法測定大鼠腎間質成纖維細胞的增殖情況。