[發明專利]鴨坦布蘇病毒多克隆抗體及其制備方法

有效

• 申請號: 201210480669.6
• 申請日: 2012-11-22
• 公開（公告）號: CN102993300A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 魏波;凌紅麗;徐麗麗
• 申請（專利權）人: 青島寶依特生物制藥有限公司;青島康地恩藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于家禽基因工程技術領域，具體涉及鴨坦布蘇病毒多克隆抗體及其制備方法。

背景技術

2010?年4?月以來，我國主要蛋鴨養殖區福建、山東、浙江、上海、江蘇等地陸續暴發一種以蛋鴨、種鴨產蛋驟然大幅下降為主要臨床特征、以出血性卵巢炎為主要病變特征的急性傳染病，造成約1.2?億只蛋鴨和1500?萬只肉鴨發病，經濟損失達數十億元。隨著病原學研究的深入，該病被確診是由一種新型黃病毒：鴨坦布蘇病毒(Duck?Tembusu?virus，DTMUV)引起的。鑒于當前如此嚴峻的形勢，建立鴨坦布蘇病毒抗體對該病的主動免疫保護和流行病學調查具有極其重要的意義。

研究發現，鴨坦布蘇病毒編碼結構蛋白(C、PrM?和E)?和非結構蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B?和NS5)。其中，E?蛋白在病毒受體結合、侵入和融合方面起到了關鍵的作用，是病毒的主要結構蛋白，具有較好的免疫原性，是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原，也成為了宿主抗感染免疫的重要保護性抗原。因此，篩選新的E?蛋白等位基因進行疫苗研發無疑具有重要的現實意義和市場開發價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒多克隆抗體及其制備方法，即以新的鴨坦布蘇病毒E蛋白基因作為免疫原產生的多克隆血清抗體，保護動物免受鴨坦布蘇病毒的感染。

本發明多克隆抗體，是以氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1的鴨坦布蘇病毒E蛋白為免疫原制備的。

上述的多克隆抗體的制備方法，包括如下的步驟：

1）取鴨坦布蘇病毒E蛋白添加到弗氏完全佐劑中至濃度為1mg/?mL，混均后制成乳劑來免疫新西蘭大耳白兔；

2）在第一次免疫后，每隔一周加強免疫一次，其中第二、三次免疫在乳劑中添加弗氏不完全佐劑，第四次注射抗原溶液；

3）自第一次免疫后的第五周起取血，室溫下待血清完全分離，離心后的血清經過純化后獲得為本發明制備的鴨坦布蘇病毒多克隆抗體。

本發明制備的多克隆抗體用于預防鴨坦布蘇病毒病。

本發明以純化的鴨坦布蘇病毒的重組E蛋白作為抗原注射新西蘭大耳白兔獲得多克隆血清，具有較好的免疫保護效果。將5日齡和35日齡的DTMUV陰性麻鴨注射多克隆血清后，對黃病毒的攻毒保護率分別達到100%和90%。用對開發敏感性高、特異性強的鴨坦布蘇病毒保護性抗體血清提供實驗基礎和較大的市場價值。

具體實施方式：

下面結合具體實施方式來進一步描述本發明，但本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的技術方案的情況下可以對本發明的技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明保護范圍內。

一、鴨坦布蘇病毒E基因的擴增

將臨床分離疑似DTMUV的病料處理后接種SPF雞胚盲傳三代后，PCR擴增鴨坦布蘇病毒E基因全長，引物序列如下：

E-F:?5’?AGAATTCATGTTCAGCTGTCTGGGGA’?3??（EcoR?I）

E-R:?5’?ACTCGAGTTAATTGACATTTACTGCCAGG?’?3???（Xho?I）

按以下參數在PCR儀上進行反應：98?℃預變性30?s，然后以98?℃?10?s、?55?℃?15?s、72?℃?1?min進行25個循環。

擴增產物進行測序后將E蛋白基因序列（SEQ?ID?NO：2）在NCBI上Blast比對，同源性最高為97%，表明擴增的樣品為新的病毒株。其翻譯的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。

同時，對同一DTMUV的病料感染的不同SPF雞胚，按照上述記載的條件進行擴增，擴增出的基因測序結果都一致，證明沒有在擴增過程中產生堿基的錯誤。

將E蛋白基因的核苷酸（SEQ?ID?NO：2）5′端和3′端分別加上EcoR?I和Xho?I酶切位點，送基因公司進行全基因合成

二、基因工程蛋白表達載體的構建與工程菌的獲得

1、?E基因片段連接到pET-28a(+)載體上并轉化DH5α感受態細胞

（1）合成的E基因與pET-28a(+)載體質粒分別利用EcoR?I和Xho?I酶進行雙酶切。

（2）酶切后目的片段的回收：雙酶切產物通過1%瓊脂糖回收膠。