[發明專利]一種評價棉鈴蟲抗性治理效果的方法

有效

• 申請號: 201210480447.4
• 申請日: 2012-11-22
• 公開（公告）號: CN102981001A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 梁革梅;魏紀珍;張麗麗;高珍;張永軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體地，涉及一種評價棉鈴蟲抗性治理效果的方法。

背景技術

棉花是關系國計民生的戰略物資，也是僅次于糧食的第二大農作物。棉鈴蟲是危害棉田的主要害蟲之一，上世紀90年代初棉鈴蟲的大爆發給我國的國民經濟造成了巨大的經濟損失。為了有效的防治棉鈴蟲，1996年轉基因棉花在美國商業化種植，之后其種植面積在世界范圍內快速增長，我國1997年由河北省開始引種美國Bt-Cry1Ac抗蟲棉，1999年國產抗蟲棉開始商業化種植。2001年以前Bt棉花主要種植于黃河流域棉區，種植面積約50萬公頃，到2006年已廣泛種植于各個棉區，面積達400萬公頃，占全國棉花種植面積的70%，2011年中國的轉基因棉花種植比例達到71.5%。

轉Bt棉花的廣泛種植在帶來巨大收益的同時，害蟲對Bt的抗藥性也成為一個不容忽視的問題。Tabashnik等2008年報道美國的東南部棉鈴蟲在田間對Bt棉產生了抗性；Tabashnik等2010報道印度從2002年開始使用第一代轉基因棉花，到2009年田間的紅鈴蟲已對Cry1Ac產生了抗性。很多國際育種公司先后開發了第二代轉基因棉花，如Monsanto公司的BollgardⅡ（表達Cry2Ab和Cry1Ac蛋白），DowAgroSciences公司的WideStrike（表達CrylF和CrylAc蛋白），Syngenta公司的VipCot（表達Vip3A和Cry1Ab蛋白）等。

轉雙價基因抗蟲棉花除擴大殺蟲譜外，還可以起到延緩靶標害蟲抗性發展的作用。因此，新蛋白的選擇基本原則是表達的兩種蛋白之間不存在交互抗性，評價新蛋白與抗性棉鈴蟲的交互抗性及蛋白間的協同作用，對未來轉雙價基因抗蟲棉花的推廣具有重要影響。轉基因植物的制備過程是一個復雜漫長的過程，受多種因素的影響，轉基因植物由于基因突變等影響，其效果具有不確定性，需要進行大量篩選工作。因此，在新基因轉入棉花前，在室內對其新型蛋白的效果進行評價可以節省大量的人力、物力、財力。

目前主要是采用多次生物測定的方法分別測定新蛋白對棉鈴蟲的防治效果、新蛋白對抗性棉鈴蟲的治理效果、兩種蛋白混用對敏感棉鈴蟲的增效；沒有評價兩種蛋白混用對抗性棉鈴蟲的治理效果。

因此迫切需要一種通過一次生物測定，就可以評價兩種蛋白混用治理棉鈴蟲的效果。

發明內容

本發明目的是提供一種評價棉鈴蟲抗性治理效果的方法，用于簡單、快速、高效的全面評價兩種蛋白的作用效果。

本發明通過二因素D-飽和最優試驗設計、采用表面涂抹法對敏感和抗性棉鈴蟲初孵幼蟲分別進行生物測定，根據回歸方程，對兩種蛋白的作用效果、主要作用因子、最優的濃度組合進行分析。

具體地，所述方法包括以下步驟：

1）選擇兩種用于治理棉鈴蟲的藥物；

2）接種敏感或抗性棉鈴蟲幼蟲；

3）觀察幼蟲死亡情況，計算死亡率；

4）建立二因素D-飽和方法建立回歸方程，評價兩種藥物的治理效果。

其中，所述藥物為Cry2Ab蛋白、Cry1Ab蛋白、CrylF蛋白、Vip3A蛋白和Cry1Ac蛋白等中的任意兩種。所述藥物的濃度為0-4.760μg/cm²。

其中，所述棉鈴蟲幼蟲的接種量為24頭以上棉鈴蟲幼蟲/單位體積藥物。所述棉鈴蟲幼蟲培養的人工飼料為改進的棉鈴蟲飼料，飼料組成包括玉米粉、黃豆粉、酵母粉、蔗糖、維生素（具體配方參照《人工飼養棉鈴蟲技術的改進》中的配方4，植物保護，梁革梅等，1999）；所述棉鈴蟲幼蟲培養的條件為溫度27±2℃，濕度75±10%，光照14:10(L:D)h。

對于敏感品系棉鈴蟲，建立回歸方程：x₁代表第一種藥物濃度編碼值，x₂代表第二種藥物濃度編碼值、代表理論死亡率，

當回歸方程的差異顯著性分析達到顯著水平時（F>F?0.05），表明實際死亡率與吻合，回歸方程能反應實際情況；

當兩因素的回歸系數差異顯著時（t>t?0.05），表明兩種藥物作用顯著；

將兩因素的回歸系數絕對值大小，絕對值大的為起主要作用的藥物；

通過交互效應、最優濃度配比分析，得到兩種藥物作用的最佳濃度配比。

優選地，所述兩種藥物為Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白時，其治理敏感棉鈴蟲濃度均為1.75-3.65μg/cm²。