[發(fā)明專利]一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210480120.7
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN103007273A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盧曾軍;劉在新;曹軼梅;孫普;李冬;包慧芳;李平花;付元芳;陳白興文;應(yīng)理;謝寶霞
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: A61K39/295
• 分類號: A61K39/295;A61K39/135;A61P31/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制備方法，一種免疫增強型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制備方法。

背景技術(shù)

口蹄疫(Foot-and-Mouth?Disease，F(xiàn)MD)是一種嚴重危害偶蹄動物的病毒性疫病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報的烈性傳染病，中國將其列為一類動物傳染病。該病主要侵染豬、牛、羊等偶蹄動物，傳播途徑多、傳播速度快，曾多次在世界范圍發(fā)生大流行。

FMD的致病因子是口蹄疫病毒(FMDV)，歸屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)的口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)。FMDV有七個血清型，分別為O、A、C、Asia?1、SAT1、SAT2、SAT3，每個血清型又可產(chǎn)生很多基因亞型，也因流行區(qū)域而分為很多的拓撲型；不同血清型之間無交叉保護反應(yīng)，同一血清型的不同譜系病毒之間的交叉免疫保護性也有差異，因而經(jīng)常需要根據(jù)流行毒與疫苗毒株的抗原關(guān)系分析，來確定用于預(yù)防流行毒株的適宜的疫苗毒株。

FMDV核酸分子為單股正鏈的RNA分子，基因組全長約8500個堿基，只含有一個大的開放閱讀框，表達產(chǎn)生的聚蛋白逐級裂解產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非結(jié)構(gòu)蛋白(Lab，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，結(jié)構(gòu)蛋白組裝產(chǎn)生病毒的衣殼結(jié)構(gòu)，非結(jié)構(gòu)蛋白則參與病毒與宿主的相互作用、抑制宿主細胞的轉(zhuǎn)錄翻譯機制、參與病毒的復(fù)制過程。病毒衣殼蛋白是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要免疫原，在結(jié)構(gòu)蛋白上存在多個構(gòu)象性的與線性的中和表位。

早期通過單克隆抗體與免疫逃逸突變株的序列分析研究表明，在O型FMDV至少存在5個功能獨立的中和性抗原表位，組成抗原位點的區(qū)段主要包括VP1的G-H環(huán)以及其C端氨基酸，VP2的31，70～73，75和77位氨基酸，VP1B-C環(huán)的43和44位點氨基酸；VP3的58位氨基酸，VP1149位氨基酸等參與構(gòu)成五個中和表位。這5個中和表位除了由VP1G-H環(huán)構(gòu)成的位點1為線性表位外，其余均為構(gòu)象表位。利用合成肽免疫實驗動物和牛的試驗似乎證明位點1是最優(yōu)勢的抗原表位，但是有的試驗結(jié)果顯示疫苗免疫后針對位點2的抗體應(yīng)答水平高于位點1；其中針對G-H環(huán)位點的免疫顯然是最重要的，因為不同血清型病毒，在G-H環(huán)附近的變異幅度最大，而且G-H環(huán)是病毒結(jié)合細胞受體的部位。VP1G-H環(huán)也是研制口蹄疫表位肽疫苗的主要基因?qū)ο螅菃为毢铣蒅-H環(huán)研制表位肽疫苗并不能誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生有效的保護性免疫應(yīng)答，還需要有T細胞表位的參與才能誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的保護性免疫應(yīng)答。

T細胞表位對于誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的中和抗體、盡早的清除病毒具有重要的作用，有學(xué)者綜合分析了不同血清型病毒抗原位點區(qū)域的差異，結(jié)果顯示B-細胞與T-細胞抗原位點區(qū)域顯示出很明顯的血清型特征，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白3A與3D上均存在T-細胞表位，有些T-細胞表位在血清型間比較保守，有些在毒株之間差異較大；其中VP4，VP1，3A，3D蛋白中均含有保守的T細胞表位，這些表位可能更易被宿主細胞表達的MHC分子識別，因而在分子疫苗設(shè)計中受到更多的關(guān)注。

現(xiàn)在使用的口蹄疫疫苗主要為全病毒抗原滅活疫苗，在疫苗的制造過程中需要動用活病毒，因而，需要達到生物安全三級標(biāo)準(zhǔn)的GMP生產(chǎn)車間來防止病毒的擴散。同時、高效疫苗的生產(chǎn)過程中，要對病毒抗原進行濃縮，因而疫苗的生產(chǎn)與制備成本較高。基因工程疫苗的研制與應(yīng)用，將為解決這些問題提供方法。目前，已經(jīng)有合成肽疫苗被批準(zhǔn)用于豬口蹄疫的免疫預(yù)防，美國也核準(zhǔn)了口蹄疫病毒基因重組腺病毒活載體疫苗新獸藥注冊申請，說明未來口蹄疫基因工程疫苗替代傳統(tǒng)滅活疫苗將是一種趨勢。基因工程疫苗的應(yīng)用也有助口蹄疫感染動物與疫苗免疫動物的鑒別診斷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制備方法，利用該方法制備的BI與TI混合表位疫苗免疫豬，能夠產(chǎn)生同等或優(yōu)于全病毒滅活疫苗的保護性免疫效果，而且對三個譜系的病毒都具有交叉保護作用，是一種新型的免疫增強型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗。

其技術(shù)方案為：