[發明專利]多肽標志物Pep5酶聯免疫檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210479522.5
• 申請日: 2012-11-22
• 公開（公告）號: CN102998452A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 魏開華;肖漢族;孫云波;傅海媛;侯利平;黃亞娟;宋純艷;楊保安;甄蓓;徐淑芳;張拓;王東茂;周曉明;原劍
• 申請（專利權）人: 北京正旦國際科技有限責任公司;湖南金健藥業有限責任公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及ELISA檢測技術，具體地說，涉及一種多肽標志物Pep5酶聯免疫檢測試劑盒。

背景技術

結腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發病率占胃腸道腫瘤的第3位。近年隨著人民生活水平的提高和飲食結構的改變，其發病率呈逐年上升趨勢，嚴重地威脅著人類健康。結腸癌常用的診斷方法有大便潛血檢查、鋇劑造影、結腸鏡檢查和血清腫瘤標志物（tumor?markers，TM），前兩種方法敏感性較低，結腸鏡檢查為侵入性檢查，較多患者難以接受。TM檢測在癌癥篩查、診斷和治療后隨訪、復發的檢出和預后判斷中發揮著重要作用。早期大腸癌患者預后較好，但患者常無臨床癥狀，診斷率很低。因此，篩選和建立用于癌癥早期診斷的、高敏感、高特異的血清學診斷技術，提供癌癥早期預警普查，具有重大意義，市場前景可觀。

目前國內外廣泛采用檢測血清中CEA、CA242來檢測結腸癌。CEA是一種糖蛋白抗原，從結腸腺癌和胚結腸黏膜組織中分離得到，是常見的結直腸癌腫瘤標記物。由于內胚層來源的惡性腫瘤如結直腸癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等均存在CEA異常表達，且CEA釋放入體循環時先經門靜脈進入肝臟,而肝臟對CEA有降解作用，可影響其在外周血液中的濃度,因此CEA診斷結直腸癌不具備特異性。CA242最早是從人結直腸癌細胞Colo205單抗發現的，是一種唾液酸化的糖類抗原，與腫瘤局部宿主抗腫瘤免疫反應有關，機體免疫抑制越明顯，血清CA242水平越高。研究者認為CA242更適用于胰腺癌和消化道惡性腫瘤尤其是結直腸癌的診斷。

血清中豐富的多肽資源在目前重大疾病診斷中發揮著重要作用。采用目前常規的臨床手段進行多肽檢測逐漸引起學術界和醫藥界的高度重視，基于多肽的腫瘤診斷技術正開始向臨床應用高速發展，腫瘤的早期預警技術也在開發之中，一些多肽的聯合應用有可能為腫瘤等重大疾病的預警提供革新性的突破。

發明內容

本發明的目的是提供一種多肽標志物Pep5酶聯免疫檢測試劑盒。

為了實現本發明目的，本發明的一種多肽標志物Pep5酶聯免疫檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有經酶（優選辣根過氧化物酶）標記的由保藏號為CGMCC?No.5269的單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。

優選地，所述檢測試劑盒還含有包被液、封閉液、清洗液、顯色液、2M硫酸、終止液和固相反應板中的一種或多種。更優選所述顯色液為TMB顯色液。

其中，以多肽標志物Pep5抗原（序列Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln的多肽，命名為Pep5）與載體蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)的偶聯物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后篩選出的雜交瘤細胞株。本發明提供的抗多肽標志物Pep5的單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105（即，抗人原發性肝癌多肽標志物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105）現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2011年9月27日，保藏號為CGMCC?No.5269。

本發明還提供利用上述檢測試劑盒定量檢測腸腺癌血清中多肽標志物Pep5方法，包括如下步驟：將待測血清與包被液包被過夜，清洗若干次，采用封閉液進行封閉，清洗若干次，加入酶標記的多肽抗體，清洗若干次，顯色液顯色，加入終止液進行終止，檢測OD_450nm值。

其中，HRP標記的單克隆抗體與血清樣品中的多肽標志物Pep5抗原發生特異性結合，并用顯色液顯色。

具體步驟如下：

1）包被：取5-30μL待測血清，加入70μL-95μL包被液，置于96孔板中，4℃放置過夜或37℃放置2小時；同時加入100μL包被液作為陰性對照；

2）清洗：棄包被液，用0.01M、pH7.4PBST緩沖液200-300μL清洗5-7次，拍干；

3）封閉：加入200-300μL?5%的脫脂奶粉，37℃靜置封閉2小時；

4）清洗：棄封閉液，用0.01M、pH7.4PBST緩沖液200-300μL清洗5-7次，拍干；

5）酶結合物：加入80-120μL?HRP標記抗體，37℃靜置1小時；

6）清洗：棄抗體溶液，用0.01M、pH7.4PBST緩沖液200-300μL清洗5-7次，拍干；

7）顯色：加入80-120μL顯色液，37℃避光孵育15min顯色；8）終止：加入30-70μL?2M硫酸，終止反應；