[發明專利]一種食管癌免疫質譜檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210479435.X
• 申請日: 2012-11-22
• 公開（公告）號: CN102998450A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 魏開華;肖漢族;孫云波;傅海媛;侯利平;黃亞娟;宋純艷;楊保安;甄蓓;徐淑芳;張拓;王東茂;周曉明;原劍
• 申請（專利權）人: 北京正旦國際科技有限責任公司;湖南金健藥業有限責任公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及生物技術及質譜檢測，具體地說，涉及一種食管癌免疫質譜檢測試劑盒。

背景技術

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤。據統計，2008年全球食管癌新發病例為482300，死亡病例為406800。食管癌分為食管癌和食管腺癌，在我國，食管癌是食管癌的主要類型，尤其是在北方地區。近年來,雖然對食管癌的治療取得了一些進展，但是食管癌的死亡率仍居高不下。究其原因，主要是其早期癥狀具有隱蔽性和非特異性，臨床發現和治療的食管癌患者大多已屬中、晚期,早期食管癌與中、晚期食管癌的預后有很大差別，經綜合治療的早期食管癌患者5年生存率可達90%以上，而中、晚期患者只有25%-40%。因此，開展食管癌的早期診斷早期治療是目前提高食管癌治療效果的有效途徑。而當食管病變局限于黏膜或黏膜下時，患者可能尚無感覺或僅有諸如輕微的梗噎感、胸骨后燒灼感等非特異性癥狀，使早期診斷食管癌非常困難。

目前，國內外常采用的食管癌檢測方法有脫落細胞學、內鏡技術、標志物檢查等方法。食管上皮脫落細胞的獲取方法有食管拉網及毛刷，經鹽水沖洗、沉淀后做涂片檢查。食管拉網法是我國沈瓊教授發明的，其特異度可達99%，敏感度為44%-90%，但由于這一方法使受檢者較為痛苦，難以作為普查手段在一般人群中開展,經過半個多世紀的實踐發現，在高發區食管拉網方法的受檢率越來越低。內鏡檢查并進行活檢是現今食管癌的主要確診手段，且隨著其他技術與內鏡的結合，產生了一些新的檢查方法，明顯提高了早期食管癌的檢出率，但其依然存在明顯的缺陷，如可能會加重受檢者的不適，診斷結果依賴于操作者的經驗和技巧等。運用組織標志物診斷食管癌，前提必然是要取得腫瘤組織或細胞，這只能通過有創的、甚至繁瑣的操作才能達到，并不適合人群普查。所以,積極尋找創傷小、檢測方便的食管鱗癌血清標志物檢測方法成為當今臨床診斷的熱點。

發明內容

本發明的目的是提供一種食管癌免疫質譜檢測試劑盒。

為了實現本發明目的，本發明的一種食管癌免疫質譜檢測試劑盒，其含有保藏號為CGMCC?No.5269的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體和固相載體，所述單克隆抗體共價連接于固相載體上。

其中，所述固相載體為包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒等。

優選地，所述單克隆抗體可固定于固相載體上，如通過共價連接方式固定于包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒上。

本發明選用的包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒（Protein?GAgarose/Protein?A?Agarose）是免疫沉淀的基質，與包被蛋白G或蛋白A的磁珠（Protein?G?magnetic?beads/Protein?A?magnetic?beads）相比，更具成本低的優點。

進一步地，本發明的食管癌免疫質譜檢測試劑盒中還含有洗脫液，所述洗脫液任選pH值2.7的0.1mol/l甘氨酸-HCl溶液、5%乙酸或含0.1%(v/v)TFA的50-70%(v/v)ACN溶液中的一種。

本發明中，抗人食管癌多肽標志物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105，是以多肽標志物抗原（序列為Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln的多肽，命名為多肽5）與載體蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)的偶聯物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后篩選出的雜交瘤細胞株。本發明提供的抗人食管癌多肽標志物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105（即，抗人原發性肝癌多肽標志物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105）現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2011年9月27日，保藏號為CGMCC?No.5269。

本發明還提供所述多肽免疫檢測試劑盒的制備方法，該方法包括如下步驟：將純化后的單克隆抗體與固相載體懸浮液混合，使得終濃度為0.15μg/μL-1.5μg/μL，在4℃旋轉孵育15分鐘-2小時，放置1-5min，沉淀，移出上清液，用100-200μL?PBS緩沖液（0.01mol/l、pH7.4）清洗所述固相載體2-5次，即得所述檢測試劑盒。

本發明還提供一種食管癌免疫質譜檢測方法，該方法包括如下步驟：利用上述檢測試劑盒從血清樣品中分離多肽標志物抗原，用高通量的MALDI-TOF-MS檢測洗脫液中的所述多肽標志物抗原，由此建立完整的多肽免疫質譜檢測方法。