[發明專利]基于黑麥EST序列的黑麥2R染色體特異的分子標記及其應用

無效

• 申請號: 201210479388.9
• 申請日: 2011-04-14
• 公開（公告）號: CN102925439A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 安調過;尹冬冬;許紅星;李立會
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 石家莊匯科專利商標事務所 13115
• 代理人: 王琪

1.基于黑麥EST序列的黑麥2R染色體特異的分子標記，其特征在于：該分子標記為根據黑麥染色體上的表達序列標簽EST序列設計的正向引物和反向引物，該分子標記為用于鑒定黑麥2R染色體的特異標記，其名稱為2-CGG62，其正向引物序列見SEQ?ID?NO：3，其反向引物序列見SEQ?ID?NO：4。

2.應用權利要求1所述的分子標記對小麥背景中的黑麥2R染色體進行鑒定的方法，其特征步驟包括：

A、分子標記的選定和制備：根據權利要求1給出的序列合成此標記引物；

B、標記引物的稀釋：將上步合成的標記引物，先用1×TE緩沖液溶解成100μmol?L^-1的母液放入-20℃的冰箱中保存，使用前吸取母液用超純水稀釋成10μmol?L^-1的工作液待用；其中1×TE緩沖液的配方為，10mmol?L^-1Tris-HCl與1mmol?L^-1EDTA，pH=8.0；

C、黑麥染色體的特異標記：

C-1、模板DNA的提?。喝〈郎y物——小麥與黑麥遠緣雜交后代材料，對照物0——不包含待測黑麥染色體的樣品，對照物1——包含待測黑麥染色體的樣品，然后利用常規DNA提取方法分別提取三者的DNA；

C-2、PCR擴增：以C-1所得DNA樣品為模板，利用步驟B所得工作液在PCR擴增儀中分別對待測物、對照物0及對照物1進行擴增；

C-3、擴增產物的檢測：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟C-2所得的擴增產物，用銀染法進行染色，并在凝膠成像儀上照相；

C-4、結果比對：將待測遠緣雜交后代材料的電泳圖譜分別與對照物0、對照物1的電泳圖譜進行比對，如果待測遠緣雜交后代材料和對照物1的電泳圖譜均有特異擴增片段，說明遠緣雜交后代材料中含有待測黑麥染色體；如果待測遠緣雜交后代材料的電泳圖譜與對照物0的電泳圖譜一致，均不含有特異擴增片段，說明遠緣雜交后代材料中不含有待測黑麥染色體。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟C-2中對所述待測物、對照物0及對照物1的DNA模板進行擴增的具體操作為，在體積為0.2ml的Eppendof管中依次加入30ng的模板DNA，1×PCR?buffer，1.5mmol?L^-1MgCl₂，200mmol?L^-1dNTP，正、反向引物各0.2μmol?L^-1，0.5U?Taq?DNA聚合酶，最后用無菌超純水補充反應體系至10μl，然后將Eppendof管放在GeneAmp9700基因擴增儀上進行擴增反應。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述擴增反應的具體程序為，先94℃預變性5min；然后94℃變性1min，根據標記引物的退火溫度退火1min，72℃延伸1min，循環38次；最后72℃延伸10min，10℃保存；標記引物的退火溫度為60℃。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟C-3中所述擴增產物的檢測方法具體為，在步驟C-2所得的擴增產物中加入上樣緩沖液2μl，混勻之后取3μl，用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳電壓為150～180V，電泳1～2h。