[發(fā)明專利]利用釀酒酵母穩(wěn)定表達(dá)重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素(1-34)ab二聯(lián)體融合蛋白

無(wú)效

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• 申請(qǐng)日: 2012-11-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103173477A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 諸葛斌;劉青霞;方慧英;諸葛健;宗紅;金堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C12N15/81;C07K19/00;A61K38/29;A61K47/48;A61P19/10;A61P5/18
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程制藥技術(shù)領(lǐng)域，是包括用DNA重組技術(shù)合成人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素基因、含有該基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主、制備融合蛋白的方法。?

技術(shù)背景

甲狀旁腺激素(human?Parathyroid?Hormone，hPTH)是由人甲狀旁腺主細(xì)胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素，成熟hPTH含84個(gè)氨基酸殘基，分子量約為9.5kD，是人體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝及骨轉(zhuǎn)換的最為重要的激素之一。小劑量、間歇性應(yīng)用hPTH對(duì)骨質(zhì)疏松癥有一定的治療效果。?

作為一種蛋白類藥物，分子量若小于20kD在代謝過(guò)程中就易被腎小球?yàn)V過(guò)，導(dǎo)致體內(nèi)半衰期較短，為了達(dá)到治療效果，一般需要頻繁或大劑量用藥，給患者帶來(lái)極大的不便。因此長(zhǎng)效蛋白藥物的開(kāi)發(fā)已成為對(duì)第一代基因工程產(chǎn)品進(jìn)行二次開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要方向，而增加其分子量則是一個(gè)通用的策略。由于人血清白蛋白(HSA)是一個(gè)穩(wěn)定的“惰性”蛋白，同時(shí)也是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體，藥物與其融合后，可以減緩自身的生物利用速度，延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期達(dá)19d之久。?

陳靜等在畢赤酵母中表達(dá)HSA-hPTH(1-34)融合蛋白，檢測(cè)到HSA-hPTH(1-34)具有生物活性，表達(dá)量可達(dá)400mg/L，分子量約為70kD，與理論值相似。此項(xiàng)研究雖然成功的表達(dá)了具有生物學(xué)活性的融合蛋白HSA-hPTH(1-34)，但是融合蛋白在畢赤酵母中表達(dá)后，其N端的PTH肽中氨基酸會(huì)被隨機(jī)偶然修飾，影響了融合蛋白的質(zhì)量，從而影響融合蛋白的實(shí)際應(yīng)用，本發(fā)明利用釀酒酵母穩(wěn)定完整的表達(dá)具有生物活性的融合蛋白HSA-hPTH(1-34)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是使融合蛋白能較完整的表達(dá)，提出一種構(gòu)建重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白釀酒酵母基因工程菌的方法。?

本發(fā)明的技術(shù)解決方案(以pYX212釀酒酵母表達(dá)載體為例描述)?

1.重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白基因在大腸桿菌中的?構(gòu)建及克隆：?

a.重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白基因的構(gòu)建：利用引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)并合成α-PTH(1-34)_ab-HSA引物，上游引物：ACCGGATCCATGAGATTTCCTTCAATT；下游引物：ATCGTCGACTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG，實(shí)線處分別是BamH?I和Sal?I酶切位點(diǎn)，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成α-PTH(1-34)_ab-HSA基因。?

b.通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成α-PTH(1-34)_ab-HSA基因，經(jīng)BamH?I和Sal?I雙酶切后與經(jīng)過(guò)相同酶切的pYX212大片斷連接，將連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliJM109進(jìn)行pYX-α-PTH(1-34)_ab-HSA的克隆。?

2.將重組質(zhì)粒pYX-α-PTH(1-34)_ab-HSA轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中表達(dá)，并進(jìn)行鑒定。?

本發(fā)明采用大腸桿菌-釀酒酵母穿梭表達(dá)質(zhì)粒pYX212，αFactor為分泌信號(hào)肽，在釀酒酵母中穩(wěn)定完整的表達(dá)融合蛋白。所表達(dá)的融合蛋白PTH(1-34)_ab-HAS檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)N端的PTH肽中氨基酸被隨機(jī)偶然修飾的現(xiàn)象。?

附圖說(shuō)明

圖1為pYX212-α-PTH(1-34)_ab-HSA重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。?

圖2為α-PTH(1-34)_ab-HSA克隆至pYX212酶切驗(yàn)證圖譜?

其中，1：重組質(zhì)粒pYX212-α-PTH(1-34)_ab-HSA雙酶切BamH?I/Sal?I；2：pYX212雙酶切BamH?I/Sal?I；M：λ-Hind?III?Marker/bp?

圖3為釀酒酵母重組菌菌落PCR的驗(yàn)證圖?

其中，M：λ-Hind?III?Marker/bp；1，2，3：α-PTH(1-34)_ab-HSAPCR擴(kuò)增圖譜；4：空白質(zhì)粒pYX212菌株α-PTH(1-34)_ab-HSAPCR擴(kuò)增圖譜?

圖4為重組釀酒酵母表達(dá)胞外蛋白驗(yàn)證圖?