[發明專利]雙峰駝GHR蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法

無效

• 申請號: 201210478258.3
• 申請日: 2012-11-22
• 公開（公告）號: CN103014008A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 陳鋼糧
• 申請（專利權）人: 新疆旺源駝奶實業有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/72;C12N15/10
• 代理公司: 烏魯木齊合縱專利商標事務所 65105
• 代理人: 湯潔

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，是一種雙峰駝GHR蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法。

背景技術

生長激素受體??(growth?hormone?receptor，GHR)是生長激素(growth?hormone，GH)的受體蛋白，由于生長激素為生物大分子，不能直接透過細胞膜，必須通過與位于靶細胞膜上的GHR結合，經過介導體將信息傳遞到細胞內，才能發揮其生物學功能。生長激素受體是由單一基因編碼的?,含有?620?個氨基酸的單鏈跨膜糖蛋白?,其胞外區?,跨膜區及胞內區分別是由約246?,24?,350個氨基酸殘基組成。它屬于細胞因子P?造血因子受體超家族的成員之一?,與其他受體具有相似的結構和功能?,尤其胞外區約?200?個氨基酸具有較顯著的同源性。

1987年?,Lueng從兔肝臟中提取并純化出?GHR?,又根據氨基酸序列首次從兔的肝臟?cDNA?文庫中克隆出?GHR?cDNA。隨后人們相繼克隆了人、?小鼠、?大鼠、?綿羊、?牛、?雞等?20多種動物的?GHR?cDNA，大多數哺乳動物的?GHR基因由?10?個外顯子和9?個內含子組成。生長激素能促進人的生長，且能調節體內的物質代謝。它主要通過抑制肌肉及脂肪組織利用葡萄糖，同時促進肝臟中的糖異生作用及對糖元進行分解，從而使血糖升高。還可促進脂肪分解，使血漿游離脂肪酸升高。饑餓時胰島素分泌減少，生長激素分泌增高，于是血中葡萄糖利用減少及脂肪利用增高，此時血漿中葡萄糖及游離脂肪酸含量上升。由于生長激素必須通過與位于靶細胞膜上的GHR結合，經過介導體將信息傳遞到細胞內，才能發揮其生物學功能，所以，組織中?GHR?含量多少?,功能正常與否都影響?GH生理效應得以發揮?,導致動物生長發育模式的變異。?

GHR在機體的生長和體內的物質代謝中有著關鍵的調控作用,雙峰駝有比較特殊的生理特性，尤其是在抗干旱耐饑渴等方面，很適合進行物質代謝研究。

發明內容

本發明提供了一種雙峰駝GHR蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法，GHR蛋白即生長激素受體??(growth?hormone?receptor，GHR)是生長激素(growth?hormone，GH)的受體蛋白，克服了上述現有技術之不足，通過對GHR從基因、蛋白質、酶活性等多方面的研究,?必然會為糖尿病、部分肝病、腎功能不全、侏儒癥、巨人癥等疾病的預防和治療帶來新的希望。雙峰駝有比較特殊的生理特性，尤其是在抗干旱耐饑渴等方面，很適合進行物質代謝研究。

本發明的技術方案之一是通過以下措施來實現的：一種雙峰駝GHR蛋白基因，該基因的核苷酸序列具有SEQ?ID?NO.1所示的序列。本發明中的雙峰駝GHR蛋白基因的cDNA序列是通過以雙峰駝肝臟組織中總RNA為模板，參考牛、人、鼠等物種的GHR蛋白基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝GHR蛋白基因cDNA序列見SEQ?ID?NO.1。

下面是對上述發明技術方案之一的進一步優化或/和改進：

上述基因的核苷酸序列具有SEQ?ID?NO.1中33-1736位的序列。在SEQ?ID?NO.1中，RT-PCR產物長度為1746bp，電泳結果見附圖1，?其中33-35位為起始密碼子ATG，1734-1736位為終止密碼子TAG，33-1736位為編碼蛋白質區域（CDS）。

本發明的技術方案之二是通過以下措施來實現的：一種雙峰駝GHR蛋白基因的重組蛋白。

下面是對上述發明技術方案之二的進一步優化或/和改進：

上述重組蛋白的氨基酸序列具有SEQ?ID?NO.2所示的序列。將雙峰駝GHR蛋白基因cDNA序列中的編碼序列（CDS）按通用密碼子翻譯成的蛋白質編碼序列見SEQ?ID?NO.2。

上述重組蛋白為具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

上述重組蛋白通過設計一對引物從雙峰駝A-FABP蛋白中得到雙峰駝肌球蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ?ID?NO.3（正向）：5’-?5’-?ATGGGCAATACTTTCCTC?-3’，

反引物，SEQ?ID?NO.4（反向）：Oligo?dT。

本發明的技術方案之三是通過以下措施來實現的：一種雙峰駝GHR蛋白基因的克隆方法，按下述步驟進行：

第一步，總RNA提取，采取雙峰駝組織樣品后，對組織樣品進行組織總RNA提取；

第二步，引物設計及合成，引物對的核苷酸序列信息如下：