[發明專利]殼聚糖在卵黃脂肪沉淀脫脂技術中的應用

在審

• 申請號: 201210476894.2
• 申請日: 2012-11-21
• 公開（公告）號: CN102924593A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 梁永利;周東順;呂素軍;金東慶;王可洲
• 申請（專利權）人: 梁永利
• 主分類號: C07K16/02
• 分類號: C07K16/02;C07K1/30
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 王汝銀

技術領域

本發明屬于生物制藥技術領域，具體涉及殼聚糖在卵黃脂肪脫脂技術中的應用。

背景技術

禽卵黃抗體是禽類B淋巴細胞在抗原物質刺激下所產生并沉積在卵黃中的一種蛋白質，主要成分為免疫球蛋白IgY（Immunoglobulin?of?yolk)，由禽類血清免疫球蛋白轉移而來，功能上相當于哺乳動物IgG（Immunoglobulin?G），結構上具有典型的免疫球蛋白空間構象，但不含絞鏈區。與哺乳動物免疫球蛋白IgG相比，禽類卵黃抗體具有很多優越性：其一，由于禽類與哺乳動物種系發生學的距離，禽類免疫球蛋白IgY不會激活哺乳動物的補體系統，不與哺乳動物免疫球蛋白IgG細胞表面Fc受體結合，更適合于生產用于檢測哺乳動物抗原的特異性抗體，在免疫檢測與診斷中具有重要意義；其二，禽類免疫球蛋白IgY具有較高的穩定性，耐酸，耐堿，耐熱，耐冷藏，抗反復凍融，抗胃蛋白酶降解，方便生產、加工、儲存和運輸，還可用于幼齡動物的經口給服；其三，卵黃中抗體濃度能長期維持或超過血清中抗體濃度，產量高，成本低，便于規模化生產；其四，從禽類卵黃中制備抗體可免去動物采血，符合現代動物保護規則，降低勞動成本；其五，產生有效免疫反應所需抗原量少，尤其是對高度保守的哺乳動物蛋白質。

作為一種高產優質的多克隆抗體，卵黃抗體IgY具有十分廣泛的用途和良好的開發應用前景，可以應用于人類和畜禽多種疾病的臨床治療、診斷和預防，可以作為免疫檢測工具應用于生物科學研究，可以用作飼料添加劑、保健品和無公害防腐劑等等。近年來，用卵黃生產制備多克隆抗體的技術已逐漸興起。除水分外，卵黃中的主要成分是蛋白質和脂肪，其比例約為1：2，其中大部分蛋白為脂蛋白，不溶于水，雖然免疫球蛋白IgY是水溶的，但在卵黃中它與脂類、磷蛋白等形成穩定的乳化狀態。所以，提取卵黃抗體IgY首先必須將卵黃中脂類組分和水溶性組分（蛋白）進行分離，即進行卵黃脫脂處理。IgY的分離純化曾一度成為難題，主要困難就在于如何去除高濃度的脂類。

自從20世紀60年代Williams發現卵黃中存在大量的抗體以來，用于提取卵黃抗體的卵黃脫脂技術就得到了關注。1980年Polson等（Immunol?Commun(Invest),1980,9(5):475-493）首先提出聚乙二醇沉淀法，1990年又改良為氯仿沉淀法（Immunol?Invest,1990,19(3):253-258）。1981年Jensenius等（Journal?of?Immunological?Methods,1981,46:63-68）提出硫酸葡聚糖沉淀法。1984年Bade和Stegemann（J?Immunol?Methods,1984,72(2):421-426）用預冷的異丙醇和丙酮沉淀蛋白并去除脂類。1988年Hatta等（J?Food?Sci,1988,53(2):425-427）用海藻酸鈉分離卵黃脂蛋白和水溶性組分，1990年又通過比較幾種天然樹膠的脫脂效果提出κ-角叉藻聚糖法和黃原膠法，κ-角叉藻聚糖脫脂效果較好但免疫球蛋白產量不如黃原膠（Agric?Biol?Chem,1990,54(10):2531-2535）。1992年Akita等（J.Food?Sci.,1992,(57):629-634）最早采用水稀釋法，并于1993年比較了水稀釋法、聚乙二醇法、硫酸葡聚糖法和黃原膠法的提純效果，結果表明：水稀釋法產量最高，依次為硫酸葡聚糖法、黃原膠法和聚乙二醇法（J?Immunol?Methods,1993,160(2):207-214）。但水稀釋法用水量較大（10倍稀釋）且操作繁瑣。1993年Horikoshi等（Journal?of?Food?Science.1993,58(4):739742）報道了冷乙醇法，但免疫球蛋白得率僅40%，且耗能高。1994年McLaren等（J?Immunol?Methods,1994,177:175-184）提出了辛酸法。2000年Deigan（Food?and?Agricultural?Immunology,2000,12:77-85）在比較了5種脫脂方法后，提出了他認為簡單而經濟的反復凍融法，但其產率低于硫酸葡聚糖法近20%；同年，Bizhanov等（Vet?Res?Commun,2000,24(2):103-113）采用藍色葡聚糖法獲得與聚乙二醇法相當的產率。2004年徐錫殿等（山東家禽,2004,2:10-11）報道了泊洛沙姆對雞卵黃的脫脂作用。2009年鄧碧華（動物醫學進展,2009,30(1):38-40）比較了泊洛沙姆和聚乙二醇的脂脫效果，認為二者沒有明顯區別，當濃度過高時都破壞抗體蛋白的水化膜從而影響抗體效價，且泊洛沙姆成本高于聚乙二醇。2011年張倫等（中國動物檢疫,2011,28(3):49-51）進行了泊洛沙姆—辛酸法對雞卵黃脫脂條件的研究，發現隨辛酸濃度加大蛋白回收率和抗體效價都逐漸降低。2012年吳博等（中國獸藥雜志,2012,46(6):42-45）比較了五種提取卵黃抗體的方法，回收率從高到低依次為辛酸法、酚沉淀法、水稀釋法、乙酸－乙酸鈉法和海藻酸鈉法，但所得卵黃抗體效價從高到低依次為辛酸法、海藻酸鈉法、水稀釋法、酚沉淀法和乙酸－乙酸鈉法。1995年，公開號為CN1117974A的中國專利公開了一種提取卵黃中抗體的新方法-甲醛脫脂法；1998年，公開號為CN1202496A的中國專利公開了一種利用苯酚使卵黃溶液破乳的苯酚脫脂法。但上述方法存在以下問題：使用大量無機或有機試劑，甚至有毒有機溶劑，有毒有害試劑的殘留很難去除；脫脂的同時也消耗蛋白，IgY損失率高，甚至會導致抗體失活；需要使用大量儀器設備，增加了脫脂成本。于是，脫脂劑無毒、無害且儀器設備使用量少以減少脫脂成本等成為卵黃脫脂技術追求的目標。公開號為CN101225103A的中國專利公開了卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術，安全、無毒，不使用大型儀器設備，但該方法使用的脫脂劑為聚乙二醇，利用的是聚乙二醇的強吸水能力打破卵黃的乳化狀態，脫脂試劑使用量較大，IgY損失率較高。