[發(fā)明專利]家蠶核型多角體病毒多基因反向重復(fù)序列和家蠶脂肪酶1基因的應(yīng)用及其重組載體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210474652.X
• 申請(qǐng)日: 2012-11-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102925484A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣亮;夏慶友;程廷才;趙萍;王根洪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京同恒源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

1.家蠶核型多角體病毒多基因反向重復(fù)序列和家蠶脂肪酶1基因在制備重組載體中的應(yīng)用，所述多基因反向重復(fù)序列的正向序列如SEQ?ID?NO.1所示，反向序列如SEQ?ID?NO.4所示，所述家蠶脂肪酶1基因如SEQ?ID?NO.11第1081-1965位所示核苷酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述家蠶核型多角體病毒多基因反向重復(fù)序列的正向序列和反向序列之間連入家蠶肌動(dòng)蛋白基因Actin?3內(nèi)含子，所述家蠶肌動(dòng)蛋白基因Actin?3內(nèi)含子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。

3.含所述家蠶核型多角體病毒多基因反向重復(fù)序列和家蠶脂肪酶1基因的重組載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于：所述家蠶核型多角體病毒多基因反向重復(fù)序列的5’端為IE1啟動(dòng)子，所述家蠶脂肪酶1基因的5’端連接家蠶中腸特異表達(dá)啟動(dòng)子P2。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體的IE1啟動(dòng)子的5’端連接Hr3增強(qiáng)子。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體是由SEQ?ID?NO.12所述的載體序列經(jīng)AscⅠ酶切后回收含家蠶核型多角體病毒多基因反向重復(fù)序列和家蠶脂肪酶1基因的片段，連接經(jīng)AscⅠ酶切的piggyBac[3×p3?EGFP?afm]載體而得。

7.權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述重組載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）合成SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后連接經(jīng)同樣雙酶切的含家蠶肌動(dòng)蛋白基因Actin?3內(nèi)含子的pMD-19載體，得pMD-19-FS-A3intron載體；克隆如SEQ?ID?NO.4所示的序列，連入所得pMD-19-FS-A3intron載體的家蠶肌動(dòng)蛋白基因Actin?3內(nèi)含子的3’端，得pMD-19-FS-A3intron-FA載體；

（2）將步驟（1）所得pMD-19-FS-A3intron-FA載體用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，將含SEQ?ID?NO.1、家蠶肌動(dòng)蛋白基因Actin?3內(nèi)含子和SEQ?ID?NO.4的片段FS-A3intron-FA連入L4440載體的IE1啟動(dòng)子IE1P和SV40終止信號(hào)序列之間，得L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40載體；

（3）克隆家蠶中腸特異表達(dá)啟動(dòng)子P2和家蠶脂肪酶1基因，將家蠶中腸特異表達(dá)啟動(dòng)子P2用KpnⅠ和NotⅠ酶切后連接經(jīng)同樣酶切的含SV40終止信號(hào)序列的pSLfa1180fa載體，得1180-P2-SV40載體，然后同時(shí)用NotⅠ和XhoⅠ酶切所得1180-P2-SV40載體和克隆的家蠶脂肪酶1基因，連接后得1180-P2-Bmlipase-1-SV40載體，載體序列如SEQ?ID?NO.11所示；

（4）克隆Hr3增強(qiáng)子，連接進(jìn)pSLfa1180fa載體得1180-Hr3載體；將步驟（2）所得L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40載體中的含IE1啟動(dòng)子IE1P和FS-A3intron-FA的片段連接入所得1180-Hr3載體，得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40載體，然后將所得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40載體用KpnⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，同時(shí)用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切所得1180-P2-Bmlipase-1-SV40載體，將含家蠶中腸特異表達(dá)啟動(dòng)子P2和家蠶脂肪酶1基因的序列連接酶切后的1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40載體，得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40載體，載體序列如SEQ?ID?NO.12所示；

（5）將步驟（4）所得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40重組載體經(jīng)AscⅠ酶切后回收含家蠶核型多角體病毒多基因反向重復(fù)序列和家蠶脂肪酶1基因的片段，連接經(jīng)AscⅠ酶切的piggyBac[3×p3?EGFP?afm]載體，得重組載體。