[發明專利]一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體及其制備方法

有效

• 申請號: 201210472708.8
• 申請日: 2012-11-20
• 公開（公告）號: CN102943092A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 胡廣東;張涌;王靜;余源;高元鵬
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學;楊凌科元克隆股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/64
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 汪人和

1.一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，包括供體載體和輔助載體；

所述的供體載體包括PiggyBac轉座子5’重復末端序列5’TR和3’重復末端序列3’TR，在5’TR和3’TR之間設有兩個絕緣子，在絕緣子序列之間設有多克隆位點；

所述的輔助載體包括PiggyBac轉座酶編碼基因Pbase，在Pbase的上游設有啟動子，在其下游設有PloyA。

2.如權利要求1所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的5’TR的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；5’TR的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.如權利要求1所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的絕緣子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

4.如權利要求1所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的多克隆位點的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

5.如權利要求1所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的Pbase的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；所述的啟動子為PTK啟動子。

6.如權利要求1所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，靠近5’TR的絕緣子與多克隆位點之間還設有相互連接的抗生素篩選基因和熒光標記基因。

7.如權利要求6所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的抗生素篩選基因和熒光標記基因的兩端分別設有兩個同向的Loxp序列：Loxp1和Loxp2；

在Loxp1與抗生素篩選基因之間還設有SV40PloyA，抗生素篩選基因與熒光標記基因通過2A序列連接，熒光標記基因與Loxp2之間還設有CMV啟動子。

8.如如權利要求7所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的抗生素篩選基因為Neo基因，所述的熒光標記基因為EGFP。

9.一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）分別合成如SEQ.ID.NO.1所示的PiggyBac轉座子5’TR和如SEQ.ID.NO.2所示的PiggyBac轉座子3’TR序列，以及如SEQ.ID.NO.3所示的雞源絕緣子序列、如SEQ.ID.NO.4所示多克隆位點的序列，然后按照5’TR-雞源絕緣子-多克隆位點序列-雞源絕緣子-PiggyBac轉座子3’TR的元件順序連接，并將所構建的片段通過TA克隆的方式克隆至pMD18-T?simple載體中，得到質粒TP；

2）擴增上游連接有2A序列的NEO基因將其克隆到pEGFP-C1質粒中EGFP的下游，得到質粒pNA；

3）以pNA為模板，以CEANF和CEANR為引物擴增CMV至PloyA之間的片段，并將所擴增的片段克隆至TP質粒中的靠近5’端的絕緣子與多克隆位點之間，得到pBNW-TP1載體；

所述的CEANF為：gagcagatct?ataacttcgt?atagcataca?ttatacgaag?ttattgcgttatcccctgat?tctgt；

所述的CEANR為：tatcgtcgac?ataacttcgt?ataatgtatg?ctatacgaag?ttatcgcttacaatttacgc?cttaag；

4）擴增PTK啟動子，并將其克隆至pEGFP-C1質粒中，得到pPTK質粒；

5）擴增如SEQ.ID.NO.5所示的Pbase編碼基因，并將其克隆至pPTK質粒中PTK啟動子的下游，得到質粒pPTK-Pbase；

6）以pPTK-PBase為模板，擴增PTK至PloyA之間的片段，并將所擴增的片段通過TA克隆的方式連接克隆至pMD18-Tsimple載體中，得到pBNW-TD2載體；

所構建的載體pBNW-TP1和pBNW-TD2共同組成通用型PiggyBac轉座子轉基因載體。

10.權利要求1所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體在外源基因轉染細胞中的應用：將外源基因克隆至供體載體的多克隆位點中，然后再與輔助載體混合轉染細胞，穩定篩選細胞單克隆。