[發(fā)明專利]一種用于檢測大豆疫霉的LAMP引物、試劑盒及其檢測方法

無效

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• 申請日: 2012-11-21
• 公開（公告）號: CN103014152A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙偉;戚仁德;汪濤
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明主要涉及一種用于檢測大豆疫霉的LAMP引物、試劑盒及其檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

大豆是世界上重要經(jīng)濟農(nóng)作物，大豆疫霉(Phytophthora?sojae）侵染大豆而引起幼苗猝死和成株的根腐病是世界大豆生產(chǎn)上的主要病害之一，每年給世界大豆產(chǎn)業(yè)帶來巨額經(jīng)濟損失。大豆疫霉菌可以在大豆生長的各個時期侵染大豆，在潮濕多雨的季節(jié)病害發(fā)生尤其嚴(yán)重，由于大豆疫霉以同宗配合的方式進行有性生殖，在發(fā)病植株上可以產(chǎn)生大量的卵孢子，植物收獲后殘留在土壤中的卵孢子就成為大豆疫霉的初侵染源，大豆疫霉的卵孢子可以在土壤中存活5年以上，因此，大豆疫霉根腐病一旦發(fā)生將很難消除。大豆疫霉是我國對外公布的A1類進境植物檢疫對象。

近年來，隨著我國大豆需求量的加大，從美國等國家進口的商品大豆日趨增多，每年進口大豆的數(shù)量幾乎超過了國產(chǎn)大豆年生產(chǎn)量的總和，而這些國家大豆疫霉病害的發(fā)生普遍較嚴(yán)重。由于大豆疫霉是典型的土傳病害，卵孢子能在土壤中長期生存，而進境大豆中所夾帶的土壤極有可能攜帶大豆疫霉病菌，增加了大豆疫病傳播擴散的風(fēng)險，這種嚴(yán)峻的形勢下，快速準(zhǔn)確地檢測病原菌和診斷病害是控制病害成災(zāi)的主要措施之一。

大豆疫霉的傳統(tǒng)檢測方法是用大豆葉碟從土壤中進行誘捕和平板培養(yǎng)或者將二者相結(jié)合，傳統(tǒng)方法在大豆疫霉檢測及菌株分離中發(fā)揮了重要作用。但大豆疫霉病原菌與其他疫霉菌的形態(tài)特征非常相似，以形態(tài)特征為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)檢測方法需要20天左右才能確定進口大豆中是否帶菌，而且該方法要求操作者具備專業(yè)的疫霉分離、形態(tài)學(xué)鑒定知識和豐富的經(jīng)驗，從而導(dǎo)致經(jīng)常出現(xiàn)漏檢，無法滿足田間疫情調(diào)查和海關(guān)檢疫的要求。

自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）發(fā)明以來，便以其快速靈敏的特性成為動植物病原物檢測的重要方法。伴隨著各個病原物基因組測序的完善，很多特異性的核酸序列被用來作為PCR反應(yīng)特異性靶標(biāo)，可以更加準(zhǔn)確地對病原物進行鑒定。但PCR作為科研機構(gòu)中普遍使用的分子操作方法，需要較為昂貴的儀器及價格不菲的分子試劑及耗材，而且其產(chǎn)物必須經(jīng)過電泳、染色后才能檢測到，使得這一技術(shù)很難在基層進行推廣和普及，但基層又常常是最需要準(zhǔn)確、快速進行病害診斷的地方。

2000年，Notomi等人研發(fā)出了一項全新的核酸擴增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP,?loop-mediated?isothermal?amplification）。該技術(shù)使用四條或六條引物，以Bst?DNA聚合酶作為擴增酶，65℃恒溫條件下對目標(biāo)片段進行擴增。其產(chǎn)物可以通過凝膠電泳進行觀察，同時可以通過目測直接進行觀察，即在反應(yīng)體系中加入羥基萘酚藍（HNB,?hydroxynaphthol?blue），溶液顏色由紫色變?yōu)樘焖{色說明存在被擴增的目的片段。LAMP技術(shù)的發(fā)明，為病原物快速檢測建立了一個良好的平臺，該技術(shù)具有非常鮮明的特點，不需要模板核酸片段的熱變性、長時間的溫度變化循環(huán)、實驗結(jié)果不需要凝膠電泳染色后進行紫外觀察，這就避免了普通PCR所需要昂貴的實驗儀器以及專業(yè)的實驗操作場所，因而該技術(shù)適合在基層、進出口檢疫部門進行快速的病原物診斷。

發(fā)展分子檢測最重要的一點就是選用合適的分子檢測靶標(biāo)。目前廣泛采用的靶標(biāo)是基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域（ITS）序列，ITS序列具有物種間高度變異和種內(nèi)保守的特性，這使得ITS序列可以在物種的各個分類水平上進行區(qū)分。但是，伴隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，各個物種基因組序列的不斷公布，發(fā)現(xiàn)很多不同種的ITS序列具有很高的相似性，使用ITS序列很難將這些種區(qū)分開。而且由于ITS在基因組中是多拷貝的，并不適合開發(fā)定量檢測方法。因此必須開發(fā)出更多的分子檢測靶標(biāo)以滿足植物病原菌分子檢測的需要。隨著疫霉基因組學(xué)的發(fā)展，不斷有新的分子靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)并用于分子檢測。在這些新發(fā)現(xiàn)的分子靶標(biāo)中，Ypt1被認為是一個適合用于疫霉菌分子檢測的靶標(biāo)。Ypt1是一個Ras相關(guān)編碼蛋白基因，其DNA序列包含多個內(nèi)含子，該基因保守編碼區(qū)和變異的非編碼區(qū)相互間隔，該基因所具有的這些特性使其非常適合作為分子檢測的靶標(biāo)。

本發(fā)明通過序列比對分析大豆疫霉和其他疫霉菌在Ypt1基因序列上的差異，設(shè)計了大豆疫霉特異性的LAMP引物，在此基礎(chǔ)上建立了大豆疫霉LAMP快速檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測大豆疫霉的LAMP引物、試劑盒及其檢測方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：