[發明專利]一種提高膽固醇氧化酶穩定性方法

在審

• 申請號: 201210472553.8
• 申請日: 2012-11-20
• 公開（公告）號: CN102943071A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 楊海麟;辛瑜;王武;張玲;陳亦
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛

技術領域

本發明涉及一種提高膽固醇氧化酶穩定性的方法，屬于酶工程領域。

背景技術

膽固醇氧化酶(COD)是膽固醇代謝過程中關鍵酶，能專一性催化膽固醇轉化為膽甾-4-烯-3-酮，它作為一種膽固醇檢測酶應用于醫療檢測領域。同時，在食品開發、抗蟲基因工程、生物農藥等方面也具有廣泛應用價值。

由于膽固醇氧化酶在保存、運輸過程中易失活，因此提高其穩定性是該酶大量應用的基礎。目前，提高酶穩定性方法主要有，蛋白質工程、固定化、添加保護劑、化學修飾等，其中固定化是較為常用的方法。戊二醛作為雙功能試劑，廣泛應用于酶固定化中，但考慮到操作復雜且試劑具有毒性，本實驗中使用碳二亞胺法固定膽固醇氧化酶，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)是一種將氨基和羧基偶聯的縮合劑，載體或蛋白羧基被碳二亞胺活化，生成中間產物，該產物再與蛋白氨基反應形成結合物。

發明內容

本發明的目的是克服了上述現有技術中的缺點，提供提高膽固醇氧化酶穩定性的方法，本發明設計巧妙、條件溫和、易操作、成本低、環境污染小、適于大規模應用。

為了實現上述目的，本發明的提高膽固醇氧化酶穩定性方法，其特點是，包括以下步驟：

(1)合成四種不同類型的羧基瓊脂糖顆粒載體；

(2)固定時間為16-20小時，所述固定溫度為4-10℃。

為了實現上述目的，在步驟(1)之前需要研究膽固醇氧化酶分子表面堿性氨基酸數目，所述單個膽固醇氧化酶分子表面堿性氨基酸數目為60個。

較佳地，在步驟(1)中，合成四種不同類型的四種不同類型的，以瓊脂糖(如Sepharose4B)為基質，分別連接天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)和脯氨酸(Pro)四種氨基酸，制備帶有不同氨基酸的羧基載體，其中優選Asp。

較佳地，所述連接Asp、Glu兩種氨基酸的載體羧基密度基本為40-50μmol/g，連接Ser、Pro兩種氨基酸的載體羧基為20-30μmol/g。

較佳地，在步驟(2)中，所述羧基載體為連接Asp的瓊脂糖顆粒，所述酶分子游離氨基與載體羧基摩爾比1∶10，總羧基與EDC摩爾比為1∶2，所述固定pH為6.0。

較佳地，所述固定時間為16-20小時，所述固定溫度為4-10℃。

較佳地，所述固定化后使用0.6mol/L?NaCl溶液洗去非特異性吸附。

所述固定化酶的熱、pH和存儲穩定性均優于游離酶。

本發明的有益效果具體如下：

1、本發明在固定前，分析了膽固醇氧化酶分子表面堿性氨基酸分布情況，便于其后進行固定化；

2、本發明以瓊脂糖為基質，通過化學合成法連接四種不同氨基酸，形成了四種不同類型的羧基載體；

3、本發明優化了膽固醇氧化酶固定化條件，增強了操作的精確性。

附圖說明

圖1是膽固醇氧化酶分子表面堿性氨基酸分布圖。

圖2是不同pH對固定化COD活力的影響

圖3是總羧基與EDC摩爾比對固定化COD活力的影響

圖4是游離酶和固定酶的熱穩定性

圖5是游離酶和固定酶的pH穩定性

圖6是游離酶和固定酶的存儲穩定性

具體實施方式

為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例詳細說明。

實施例1不同氨基酸載體對固定化COD活力的影響：

稱取四種不同氨基酸的羧基載體1g于15mL的離心管中，按照總羧基與EDC摩爾比1∶10、載體羧基與膽固醇氧化酶氨基摩爾比25∶1的比例加入EDC和膽固醇氧化酶的量，加入磷酸緩沖液至溶液總體積為10mL，調節溶液pH至7.0，4-10℃、50r/min振蕩固定16-20小時。混合物6000rpm離心5min，取出沉淀后，用8mL0.6mol/L?NaCl于4℃洗滌1h，混合物8000rpm離心5min，測定上清液未偶聯的酶活力，過濾除去上清液得固定化酶，測定固定化酶活力，計算相對酶活力(％)。

將不同固定化酶置于37℃水浴鍋內，24小時后測定酶活力，計算酶活力保留率(％)。

不同載體表現出不同的穩定效果，為了增強酶穩定性，選擇載體-Asp作為最佳的固定載體，結果見表1。

表1不同氨基酸載體對固定化COD活力的影響

實施例2膽固醇氧化酶氨基與載體羧基摩爾比對固定化COD活力的影響：