[發明專利]一種用于檢測辣椒疫霉的引物及其檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201210472506.3
• 申請日: 2012-11-21
• 公開（公告）號: CN103103255A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 戚仁德;趙偉;汪濤
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

1.一種用于檢測辣椒疫霉的引物及其檢測試劑盒，其特征在于所述的辣椒疫霉分子檢測引物為：

上游(20bp)?PcyktF:?AGATGGTATGTCGCTATGAC

下游(20bp)?PcyktR:?ACATTTCGTAACGTCAACAT，

所述的疫霉屬通用引物為：

上游（21bp）PyktF：AGAGTTGCTGCGCCAGGATGG

下游（21bp）PyktR：GTCTTGGACAACACGGCGGTG所述的檢測試劑盒為：

檢測溶液Ⅰ包括：?25mmol?Tris.Cl(PH?8.3)、125mmol?KCl、3.75?mmol?MgCl₂、0.25mmoldNTPs、疫霉屬的通用引物PyktF/PyktR各?1μmol、0.1mgBSA、Taq?DNA聚合酶50U，加入超純水制備成1mL檢測溶液；保存期限為1年；

檢測溶液Ⅱ包括：25mmol?Tris.Cl(PH?8.3)、125mmol?KCl、3.75?mmol?MgCl₂、0.25mmoldNTPs、辣椒疫霉疫霉特異性引物PcyktF/PcyktR各?1μmol、0.1mgBSA、Taq?DNA聚合酶50U，加入超純水制備成1mL檢測溶液；保存期限為1年；

所述的檢測試劑盒的使用方法為：

當直接使用辣椒疫霉特異性引物進行檢測時，提取待檢測物DNA，取5μL溶液作為反應模板，取試劑盒Ⅱ中的溶液10μL，另取10μL去離子水加入200μL反應小管中，混勻后PCR擴增，程序為94℃變性3分鐘，94℃變性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸30秒；32?個循環，最后72℃延伸5分鐘；

當使用套式PCR進行檢測時，提取待檢測物DNA，取5μL溶液作為反應模板，取試劑盒Ⅰ中的溶液10μL，另取10μL去離子水加入200μL反應小管中，混勻后PCR擴增，程序為94℃變性3分鐘，94℃變性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸30秒；32?個循環，最后72℃延伸5分鐘；將反應結束后的PCR產物用水稀釋5倍后取5μL，取試劑盒Ⅱ中的溶液10μL，另取10μL去離子水加入200μL反應小管中，混勻后PCR擴增，程序為94℃變性3分鐘，94℃變性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸30秒；32?個循環，最后72℃延伸5分鐘；

擴增產物的電泳檢測：取10μL?PCR擴增產物，在1%（質量體積比）的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓為120V，20分鐘后在紫外光下檢測結果；如果存在分子量約為282bp的條帶，則證明所檢病原為辣椒疫霉。