[發明專利]一種鑒別安徽霍山產金線蓮及其相似種的分子標記指紋圖譜

有效

• 申請號: 201210472484.0
• 申請日: 2012-11-20
• 公開（公告）號: CN103060438A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 鄧輝;余茂耘;胡言龍
• 申請（專利權）人: 六安同濟生生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術領域

本發明涉及金線蓮的指紋圖譜，尤其是涉及金線蓮種質鑒定指紋圖譜的構建方法及其應用。?

背景技術

我國蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoectochilus)有23種左右，為多年生草本植物，通稱金線蓮或金線蘭,?素有“藥王”、“金草”、“神藥”、“鳥人參”等美稱。在我國主要分布于亞熱帶地區即福建、廣東、廣西、浙江、江西、海南、云南、四川、貴州以及西藏南部等省區，其中以閩、浙、贛和臺灣為主產地。金線蓮是我國傳統的珍貴藥材，有清涼解毒、滋陰降火、消炎止痛之功效，對無名腫痛、發燒、止瀉、蛇傷均有顯著療效，且使用安全、無毒副作用^[3]。經有關部門測定發現，金絲蓮中氨基酸組成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于國產和野生西洋參。幾百年來作為民間常用草藥。經閩臺各大醫院臨床應用，金線蓮具有肝保護、抗HBV、抗氧化、抗腫瘤活性、降高血糖、降高血脂、降高血壓、降高尿酸、小兒哮喘、小兒抽動-穢語、抗炎、利尿、鎮靜、止痛等多種治療功效。同時，金線蓮株型小巧、葉型優美、葉脈金黃色呈網狀排列是觀賞價值極高的室內觀葉珍品。?由于金線蓮的優良品質，其日益受到世人青睞，但金線蓮的分類和不同種間的藥效差別一直沒有定論，在民間，藥商將花葉開唇蘭屬中帶黃色或白色葉脈的種類以及斑葉蘭屬(Goodyera)中外形近似種均當作金線蓮收購。在人工栽培中也是將花葉開唇蘭屬與斑葉蘭屬中很多種都當作金線蓮，還有血葉蘭也叫金線蓮，造成金線蓮種源混雜。這與中藥材規范化標準化要求相去甚遠，也會給規模化生產帶來風險，所以急需開展金線蓮優良種源篩選和鑒定研究，以期篩選和保護農藝性狀優良、藥用成分含量高的優良品種資源，為其進一步大規模開發利用和科學研究提供參考和借鑒。?

安徽霍山是已知蘭科植物——金線蓮地理分布的最北端,其特殊的地理環境和生態環境使霍山產金線蓮的品質與眾不同，為保護和開發利用這一優異品種，大別山瀕危蘭科植物保育科學研究中心聯合安徽六市同濟生生物科技有限責任公司開展了種質資源鑒定研究。?

1994年,加拿大蒙特利爾大學Zietkiewicz等首次發明了串聯重復序列區間片段多態性標記（ISSR，Inter?simple?sequence?repeat，ISSR）技術，之后ISSR分子標記技術在全世界不斷得到推廣和應用。由于SSR序列在基因組中廣泛分布(Roderetal.，1998)，且等位變異特別豐富，因此ISSR與其它多態性分子標記技術RFLP、AFLP和RAPD相比，可以檢測到更高的多態性，同時錨定堿基使基因組上只有那些與錨定堿基匹配的位點才能被靶定，避免了SSR在基因組上的滑動，大大提高了PCR擴增的穩定性和可重復性，因而ISSR分子標記技術非常適合于種間和種下關系的分析。本文利用ISSR-PCR技術對安徽、湖北、廣東、福建和臺灣等5省10地用于藥用的優質金線蓮品種進行了居群間的種下鑒別，旨在建立一個較為完整可靠的金線蓮ISSR—PCR反應系統，為今后研究金線蓮地理種源的群體遺傳多態性和廣泛的良種選育與雜交提供分子水平上的參考和借鑒。?

雖然通過保守序列設計引物進行PCR產物測序，依據核苷酸序列來鑒定藥用植物的方法具有科學性和可靠性，但存在成本高、程序復雜和耗時長等缺點。本發明研究利用ISSR分子標記方法來鑒定金線蓮及其相似種，通過對金線蓮及其相似種植物的ISSR分子標記指紋圖譜研究，具有多態性豐富，差異穩定，且操作相對簡便、成本經濟等優點。?

發明內容

為了解決現有技術鑒定藥用植物的方法成本高、程序復雜和耗時長的問題，本發明提供一種鑒定操作簡便快捷、重復性好、分辨率高的金線蓮及其相似種的分子標記指紋圖譜的構建方法和應用。?

本發明的技術方案是利用ISSR分子標記技術來構建金線蓮的分子標記指紋圖譜，并利用所構建的指紋圖譜實現安徽霍山紅葉金線蓮及其相似種的鑒定。?

本發明的具體操作，包括以下步驟：?

（1）新鮮金線蓮樣品預處理?

將新鮮金線蓮樣品避光6個小時以上消耗淀粉，取新鮮的金線蓮葉片10克，用50克以上無水乙醇浸泡二次，每次10分鐘，擦干；?

（2）樣品基因組DNA的提取?

采用改進的CTAB?法提取金線蓮葉片基因組DNA，操作如下：?

1)?將預處理后的葉片放入冰凍過的陶瓷研缽中，并加入適量石英沙，然后?多次加入液氮充分研磨至粉末狀，用藥匙將葉片粉末迅速轉移到10ml預冷Eppendorf離心管中，粉末的高度達到離心管的1/3處，停止加入粉末；?