[發明專利]一種金錢松細胞的懸浮培養方法

有效

• 申請號: 201210472291.5
• 申請日: 2012-11-20
• 公開（公告）號: CN102994444A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 王躍華;楊小萍;袁暢;王強;黃興;王丹;宋超;覃澤嬌;王朝君;吳佳靚;熊云翔;江明殊
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N5/02
• 代理公司: 成都科奧專利事務所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

1.一種金錢松細胞的懸浮培養方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）愈傷組織的誘導培養：選取落葉后生長健康、無病蟲害的金錢松植株上的芽，剝去芽上的芽鱗片后將芽進行消毒處理，再將已消毒的芽接入固體培養基MS+6-BA1.0～2.0?mg·L^-1+NAA0.5～4.0??mg·L^-1?+蔗糖20～50?g·L^-1?+瓊脂5.0～7.0?g·L^-1中進行培養，培養溫度10～30?°C、pH值為5.6～6.5、每天光照4～16小時、光照強度為1000～2000?lx；

（2）細胞的預培養：將步驟（1）中獲得的愈傷組織轉接入液體培養基MS+6-BA0.5～1.5?mg·L^-1+2、4-D?1.0～4.0?mg·L^-1+KT^?0～2.0?mg·L^-1+蔗糖20～50?g·L^-1?中進行5～8天的預培養；

（3）細胞的懸浮培養：選取預培養后處于懸浮培養液中部和上部的金錢松單個細胞或疏松細胞小聚集體，以20～50?g·L^-1的接種量轉接到B5+6-BA0.1～1.0?mg·L^-1+2、4-D?2.0～5.0?mg·L^-1+KT^?0.1～1.0?mg·L^-1+蔗糖20～50?g·L^-1的液體培養基中進行細胞的懸浮培養；

（4）細胞的繼代培養：在細胞懸浮培養了28～32天進行第一次繼代培養，以后每隔15～25天繼代一次；

上述（2）、（3）、（4）步驟中金錢松細胞的液體培養條件均為溫度15～28°C，pH值4.0~7.0，每天光照6～12小時，光照強度為1000～1500?lx，搖床轉速為110～140r·min^-1。

2.根據權利要求1所述的一種金錢松細胞的懸浮培養方法，其特征在于：步驟（1）中所述消毒處理是指將芽鱗片先用濃度為70%的酒精消毒10~50s，再用濃度為0.1?%~0.15?%的升汞消毒3~5?min，最后用無菌水沖洗2~5次。