[發(fā)明專利]尿液間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及擴(kuò)增培養(yǎng)方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210470118.1
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN102925409A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪泱;關(guān)俊杰;鄧志鋒;張長青;龔飛翔;牛鑫;田壽福;胡斌;郭尚春
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市第六人民醫(yī)院;汪泱
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/077;C12N5/079;C12N5/071;A61L27/38
• 代理公司: 上海科盛知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

1.一種尿液間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)尿液的獲取：在無菌條件下，取健康人的清潔中段尿液200-250ml，加入5ml抗生素，立即進(jìn)行下一步驟；

(2)初步離心：將清潔尿液分裝至50ml離心管中，400g離心10min，棄上清；

(3)洗滌：用PBS洗滌沉淀后以400g離心10min，并重復(fù)該步驟一次；

(4)細(xì)胞計(jì)數(shù)、活性檢測和培養(yǎng)；取100μL細(xì)胞重懸液并應(yīng)用臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活性并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種至含有無血清培養(yǎng)基的六孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(5)細(xì)胞擴(kuò)增：在培養(yǎng)3-7天后在相差顯微鏡下觀察，如觀察到細(xì)菌污染則棄去，無污染則繼續(xù)培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)單個細(xì)胞貼壁生成，標(biāo)記單個細(xì)胞在六孔板中的位置，再連續(xù)觀察7-10天后，吸取原培養(yǎng)液，PBS洗滌尿液中的殘?jiān)^續(xù)培養(yǎng)14-21天后，可以陸續(xù)觀察到克隆逐漸向四周延伸，克隆逐漸變大，待細(xì)胞達(dá)到80％左右的融合度后，胰蛋白酶消化離心，重懸后得到間充質(zhì)干細(xì)胞，傳至另一六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

(6)細(xì)胞誘導(dǎo)分化：分別取5-10代的尿液間充質(zhì)干細(xì)胞加入不同的細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)其向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于：所述抗生素為含有青霉素100U/ml和鏈霉素0.1mg/ml的抗生素。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于：所述細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件是：溫度37℃，5％CO₂飽和濕度。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于：所述無血清培養(yǎng)基為含有人表皮生長因子、胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、皮質(zhì)醇、硫酸慶大霉素-兩性霉素B、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腎上腺素和三碘甲狀腺氨酸的培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基包括成骨分化培養(yǎng)基、成軟骨分化培養(yǎng)基、成脂肪分化培養(yǎng)基、神經(jīng)分化培養(yǎng)基和成血管內(nèi)皮分化培養(yǎng)基；成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)尿液間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化；成軟骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)尿液間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化；成脂肪分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)尿液間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化；神經(jīng)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)尿液間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化；成血管內(nèi)皮分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)尿液間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的尿液間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的成骨分化培養(yǎng)基為含有10-100mg/L維生素C、2-20mmol/L?β-甘油磷酸鈉、1-10nmol/L地塞米松的細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；所述的成軟骨分化培養(yǎng)基為含有10-100ng/ml轉(zhuǎn)化生長因子-1(TGF-β1)、10-100ng/ml胰島素生長因子-1(IGF-1)和4-40ng/ml地塞米松的細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；所述的成脂肪分化培養(yǎng)基為含有10-100nmol/L地塞米松、50-500μmol/L異丁基甲基黃嘌呤、10-100μmol/L吲哚美辛的細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；所述的神經(jīng)分化培養(yǎng)基為含有2％二甲亞砜和200μmol/L羥基丁酸苯甲醚的細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；所述的成血管內(nèi)皮分化培養(yǎng)基為含有10-100μg/L血管內(nèi)皮生長因子、5-50μg/L表皮生長因子、0.1-1μmol/L地塞米松的細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

7.尿液間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于：用于修復(fù)骨缺損或股骨頭壞死、關(guān)節(jié)軟骨損傷、中樞或外周神經(jīng)損傷、皮膚損傷、血管損傷，以及由心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病或泌尿系統(tǒng)疾病造成的相應(yīng)組織器官損傷。