[發(fā)明專利]促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖及延緩衰老的活性基質(zhì)膠

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210469902.0
• 申請(qǐng)日: 2012-11-19
• 公開（公告）號(hào): CN103820386A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓為東;郝好杰;付小兵;劉杰杰;趙亞力;伍志強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 北京北新智誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11100
• 代理人: 王淳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于體外培養(yǎng)，可以延緩間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal?stemcells，MSCs）的復(fù)制性衰老、促進(jìn)細(xì)胞增殖并維持MSCs的“干性”的活性基質(zhì)膠。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs是來(lái)源于中胚層的一類成體干細(xì)胞，可從骨髓、臍帶、胎盤、肌肉、脂肪等多種組織中分離出來(lái)。MSCs具有自我更新以及多向分化的潛能，在體內(nèi)整個(gè)生命周期、以及疾病與創(chuàng)傷條件下參與組織器官的更新與修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)特性及分泌豐富的營(yíng)養(yǎng)因子，且具極低的免疫原性，因此具有廣泛的臨床應(yīng)用研究的潛能，已被應(yīng)用于缺血性心臟病、免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、GVHD等臨床基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。但是，原始存在于骨髓、脂肪的MSCs的數(shù)目較少，難以滿足臨床治療和研究方面的需求，因此需要在體外對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增。然而，像人體其它體細(xì)胞一樣，間充質(zhì)干細(xì)胞的體外的擴(kuò)增培養(yǎng)，由于體外失去體內(nèi)干細(xì)胞生存的微環(huán)境，在體外培養(yǎng)中從開始就存在著復(fù)制性衰老的特性，使MSCs的分化能力及自我更新能力以及相關(guān)的特性隨著衰老的逐漸加重而丟失。使得人們很難獲得既能滿足數(shù)量上的需求又保持干細(xì)胞的特性的細(xì)胞，因此嚴(yán)重制約了間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。

間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)能保持自我更新及復(fù)制能力是取決于所處的干細(xì)胞微環(huán)境的緣故。研究表明，干細(xì)胞生存的微環(huán)境，包含了包括細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分及眾多的細(xì)胞因子的適宜調(diào)控因素，調(diào)節(jié)著干細(xì)胞的特性包括自我更新及多向分化的能力。因此，人們?cè)噲D體外模擬體內(nèi)干細(xì)胞微環(huán)境解決體外培養(yǎng)擴(kuò)增存在的復(fù)制性衰老的難題。模擬微環(huán)境含有的主要成分是膠原蛋白，在一定程度上促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及延緩了衰老的出現(xiàn)。同時(shí)使用MSCs特異的ECM，即用來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的ECM為自然的成分模擬體內(nèi)微環(huán)境，在體外明顯促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，抵抗復(fù)制性衰老的過早出現(xiàn)。體外利用ECM成分模擬體內(nèi)微環(huán)境，在一定程度解決了復(fù)制性衰老的問題。但是，由于參與干細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控的既有ECM成分又包括了細(xì)胞因子成分，是個(gè)復(fù)雜的有機(jī)體，現(xiàn)有的合成的方法很難再現(xiàn)其復(fù)制性。利用MSCs的ECM構(gòu)建的干細(xì)胞的微環(huán)境，由于MSCs本身存在的衰老的及無(wú)法大量制備等缺陷更限制了其大量制備，限制了其在臨床及基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。因此，隨著MSCs大量的臨床及基礎(chǔ)研究的開展，亟待解決其在體外培養(yǎng)過程中存在的復(fù)制性衰老的的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供一種能在體外包被培養(yǎng)皿的表面模擬體內(nèi)微環(huán)境，延緩MSCs的衰老的發(fā)生、促進(jìn)MSCs增殖的制品。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖及延緩衰老的活性基質(zhì)膠，其特征在于，其是通過以下方法制得：

（1）將切除的臍帶置于保存液內(nèi)，所述保存液為含100u的青霉素及100μg的鏈霉素的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，在4℃下保存直至處理；

（2）在無(wú)菌條件下用磷酸鹽緩沖液沖洗臍帶，以75%乙醇浸泡20秒，取出后分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm³的小塊；

（3）轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，加入等體積的磷酸鹽緩沖液置4℃下48小時(shí)，間或震蕩，溶脹組織；

（4）用高速勻漿機(jī)4℃下勻漿打碎，再用玻璃勻漿器4℃勻漿后，再次用高速勻漿機(jī)4℃下盡量將勻漿打碎；

（5）以12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，取上清，即得到所述活性基質(zhì)膠成品。

如上所述的活性基質(zhì)膠，優(yōu)選地，步驟（1）中，所述臍帶在4℃下保存不超過24小時(shí)。

如上所述的活性基質(zhì)膠，優(yōu)選地，步驟（2）中，所述用磷酸鹽緩沖液沖洗臍帶為沖洗3次。

如上所述的活性基質(zhì)膠在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖及延緩衰老中的用途，其特征性在于，所述的用途是將來(lái)源于動(dòng)物或人體的間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)于所述活性基質(zhì)膠，從而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖及延緩其復(fù)制性衰老。

如上所述的用途，優(yōu)選地，將所述活性基質(zhì)膠以磷酸鹽緩沖液0.05-10%g/mL的濃度，于培養(yǎng)容器中37℃下包被2小時(shí)，或4℃下包被16-24小時(shí)后，用于所述間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

一種促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖及延緩衰老的活性基質(zhì)膠的制備方法，其特征在于，所述制備方法的步驟如下：

（1）將切除的臍帶置于保存液內(nèi)，所述保存液為含100u的青霉素及100μg的鏈霉素的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，在4℃下保存直至處理；