[發明專利]一種腸炎沙門氏菌的檢測方法

無效

• 申請號: 201210469503.4
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN103820536A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 謝克煥
• 申請（專利權）人: 大連德通生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/42
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明主要涉及食品質量檢測領域，屬于微生物檢測方法，具體涉及一種沙門氏菌PCR檢測方法。

背景技術

沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)為腸桿菌科沙門氏菌屬，據其抗原結構和生化試驗，目前已有2000余種血清型，其中以鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌較為多見。該菌為革蘭氏陰性桿菌，需氧，不產生芽胞，無莢膜，絕大多數有鞭毛，能運動。對外界的抵抗力較強，在水和土壤中能活數月，糞便中能活1～2個月，在冰凍土壤中能越冬。不耐熱，55℃、1h或60℃、10～20分鐘死亡，5%石炭酸或1：500升汞5分鐘內即可將其殺滅。多種家畜（豬、牛、馬、羊）、家禽（雞、鴨、鵝）、魚類、飛鳥、鼠類及野生動物的腸腔及內臟中能查到此類細菌。細菌由糞便排出，污染飲水、食物、餐具以及新鮮蛋品、冰蛋、蛋粉等，人進食后造成感染。致病食物以肉、血、內臟及蛋類為主，值得注意的是該類細菌在食品中繁殖后，并不影響食物的色、香、味。

沙門氏菌屬有的專對人類致病，有的只對動物致病，也有對人和動物都致病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發生食物中毒。據統計在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國內陸地區也以沙門氏菌為首位。

由沙門氏菌引起的食源性疾病的全球公共健康問題。在歐洲ISO6579:2002和FSISMLG4.04中；檢測沙門氏菌是評估產品是否合格的必檢項目。在美國，通常是肉，禽，蛋產品中檢測出沙門氏菌。

由沙門氏菌引起了食源性疾病的全球公共健康問題。沙門氏菌是最常見的，新鮮家禽和豬的肉陽性標本的比例，根據歐洲標準（歐盟委員會法規2073/2005）用于評價產品是否符合標準，經分別檢測平均為5.5％和1.1％。此外，美國食品安全檢驗局采用FSIS的方法，檢測沙門氏菌。這兩個標準的用于檢測沙門氏菌培養方法（SCMS）需要長達5天，才能獲得結果。這些方法包括預培養，在選擇性瓊脂上選擇性分離，可疑菌落的生化鑒定和血清學確認。該方法是雖然準確，但費力，成本高，費時，且對短保質期的產品無法檢測。目前，檢測沙門氏菌的方法檢測時間長，費用較高，不利于在基層單位推廣使用。

因此，需要有新的方法能夠在一個短的時間內檢測，最好能在24小時之內，在一個給定的食物量中檢測食品中的病原體。

發明內容

本研究的目的是：建立一個新的檢測食品中的病原體的方法。為達到直接在食品中腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)檢測的目的。本發明采用Primer?Express1.5軟件中設計的引物，提供一種沙門氏菌PCR檢測引物，其為：

F：CACCAGGAGATTACAACATGACG????SEQ?ID?No.1

R：CTAGCTCACACCAAAAGTGACCA????SEQ?ID?No.2。

其中，所述的引物擴增片段為180bp左右的片段，根據電泳結果，即可判斷為是否存在病原體基因。

本發明還提供含有上述引物的沙門氏菌PCR檢測試劑盒，所述試劑盒還可包括PCR緩沖液、dNTPs、純化水和Taq?DNA聚合酶等。

本發明還提供應用上述的試劑盒在食品中檢測沙門氏菌的方法，其包括：

1)提取食品中的DNA；

2)以步驟1提取的DNA為模板進行PCR擴增；

3)對PCR產物進行電泳檢測。

其中，所述的PCR反應體系為：每20μl的反應液中，含有(1)引物上、下游各15mM，100μl；(2)10×PCR緩沖液，1.5ml；(3)10mM?dNTPs，1.5ml；(5)5U/μl?Taq?DNA聚合酶，100μl；(4)純化水，3.0ml。

(1)引物上、下游各15mM，100μl；

(2)10×PCR緩沖液(含Mg²⁺?20mM)，1.5ml；

(3)dNTPs(10mM)，1.5ml；

(4)純化水，3.0ml；

(5)Taq?DNA聚合酶(5U/μl)，100μl。

其中，所述的PCR反應條件為：95℃預變性1min，95℃變性30s，60℃退火50s，72℃延伸1min，共35個循環，最后72℃延伸10min。