[發(fā)明專利]一種WSSV囊膜蛋白原核表達包涵體的變復性方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210468427.5
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN102924580A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設計）人: 李鵬;嚴潔;馬曉燕;周開亞
• 申請（專利權(quán)）人: 南京師范大學
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C07K1/14
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于微生物學領域白斑綜合癥病毒（White?spot?syndrome?virus，WSSV）蛋白體外原核表達實踐中的一種技術(shù)革新，具體涉及一種WSSV囊膜蛋白原核表達包涵體的變復性方法，其能有效提升包涵體的復性效率達95%以上并獲得可溶性蛋白。

背景技術(shù)

白斑綜合癥病毒已在全球范圍內(nèi)成為蝦類中最普遍的、分布最廣、最致命的病毒。但目前然沒有可用來控制該病毒發(fā)生和傳播的辦法。給世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。因此，弄清其致病機理，成為有效防治的基礎。

目前，研究結(jié)果一致認為，囊膜蛋白在對蝦白斑綜合癥病毒與宿主的相互作用中扮演著重要的角色。但其致病機理尚不明了，因此，WSSV囊膜蛋白也成為國內(nèi)外科技工作者的研究熱點。大多數(shù)研究工作的前提均是通過構(gòu)建WSSV囊膜蛋白的體外重組原核表達體系獲取可溶性的體外表達蛋白。然而，在進行WSSV囊膜蛋白的體外重組原核表達時經(jīng)常獲得的表達產(chǎn)物為不溶的、無活性的固體顆粒，即包涵體。若想獲得可溶性蛋白，通常的做法是對包涵體進行變復性。包涵體的復性是一個復雜的過程，復性成功與否很大程度上和蛋白本身的性質(zhì)有關(guān)。有些蛋白在寬松的條件下復性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今還沒有發(fā)現(xiàn)對其進行復性的有效方法，一般來說，蛋白質(zhì)的復性效率在20%左右。目前已知的很多包涵體變復性方法應用于WSSV囊膜蛋白原核表達的包涵體變復性時均存在各方面的缺點，例如復性效率低或無法獲得可溶性蛋白等等。因此一種有效的WSSV蛋白原核表達包涵體的變復性方法是進行大規(guī)模WSSV囊膜蛋白體外原核表達研究所迫切需要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種WSSV囊膜蛋白原核表達包涵體的變復性方法。該方法能使WSSV蛋白原核表達形成的包涵體的復性效率達到95%以上，最終獲得可溶性蛋白。

本發(fā)明的基本原理是：（1）在包涵體中加入變復性添加劑并劇烈攪動，使沉淀緩慢溶解；（2）低溫離心丟棄剩余的沉淀；（3）通過透析法逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，最終通過濃縮得到可溶性的蛋白。

本發(fā)明所述WSSV囊膜蛋白原核表達包涵體的變復性方法包括變復性添加劑劑量、沉淀溶解、緩沖液劑量、透析復性的過程。作為處理對象的WSSV囊膜蛋白原核表達包涵體在此前通過超聲破碎細胞、低溫離心獲得。

本發(fā)明所述WSSV囊膜蛋白原核表達包涵體的變復性方法，具體的步驟如下：

1）向WSSV囊膜蛋白原核表達包涵體中加入含8M尿素的10mM?Tris-HCl，pH8.0，劇烈攪動，25℃下用磁力攪拌器不斷攪拌3-4小時，使沉淀緩慢溶解；

2）4℃，12000rpm離心12min，棄沉淀；

3）在所得上清液中加入pH8.0的磷酸鹽緩沖液，以pH8.0的磷酸鹽緩沖液透析20-22小時，然后用PEG-20000濃縮得可溶性蛋白。

對于冷凍保藏的包涵體，在采用本發(fā)明方法前要進行預處理，即用10mM?Tris-HCl（pH8.0）溶液重懸超聲離心得到的沉淀（沉淀即為超聲破碎細胞、低溫離心獲得的包涵體），12000rpm，離心10min，棄上清。

預處理中，重懸液的用量優(yōu)選20-30ml。

步驟1）中變復性劑量優(yōu)選8ml含8M尿素的10mM?Tris-HCl。

步驟3）中緩沖液的劑量優(yōu)選15-20ml?pH8.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）（PBS可使尿素的濃度降低以利于復性）以pH8.0的PBS緩沖液透析20-22小時（期間換6-8次透析液），然后用PEG-20000濃縮到約1ml。

取30μl樣品加入7.5μl的5×LSB上樣緩沖液，100℃沸水處理5-10min，12000rpm離心10min后取5μl上清上樣，SDS-PAGE檢測復性情況。

本發(fā)明的有益效果是：通過WSSV蛋白原核表達包涵體的變復性方法革新，對各研究所或?qū)嶒炇疫M行WSSV蛋白原核表達時產(chǎn)生的包涵體進行變復性從而獲得可溶性的體外表達蛋白具有指導作用。

附圖說明

圖1.SDS-PAGE分析VP32蛋白包涵體變復性（泳道1,2：VP32；泳道M：Marker）。

具體實施方式

實施例一

本發(fā)明實施例一提供一種WSSV囊膜蛋白VP32原核表達形成的包涵體的變復性方法，下面進行詳細說明：