[發(fā)明專(zhuān)利]大景深三維納米分辨成像方法、光學(xué)組件及成像系統(tǒng)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210467807.7
• 申請(qǐng)日: 2012-11-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102980875A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于斌;陳丹妮;牛憨笨;李恒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/64
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/64;G01B11/00;G02B21/36;G02B27/22
• 代理公司: 深圳中一專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 44237
• 代理人: 張全文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于顯微成像技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種大景深三維納米分辨成像方法、光學(xué)組件及成像系統(tǒng)。

背景技術(shù)

細(xì)胞是生物體及生命活動(dòng)的基本單元，對(duì)細(xì)胞的深入研究是揭開(kāi)生命奧秘，改造生命和征服疾病的關(guān)鍵。在完整細(xì)胞下進(jìn)行分子成像，進(jìn)而獲取亞細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)甚至分子圖譜，并能在活體細(xì)胞下獲取這些結(jié)構(gòu)變化及分子動(dòng)態(tài)過(guò)程的信息一直是細(xì)胞學(xué)研究的重要方向。同時(shí)，對(duì)完整細(xì)胞進(jìn)行納米分辨三維結(jié)構(gòu)和功能成像，在更高水平上認(rèn)識(shí)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與細(xì)胞功能變化的關(guān)系和規(guī)律，是生命科學(xué)的迫切需求，也是對(duì)成像科學(xué)的重大挑戰(zhàn)。

近年來(lái)，遠(yuǎn)場(chǎng)納米分辨熒光顯微成像技術(shù)取得了較大的發(fā)展。目前最為突出的方法有兩種，一種是基于縮小有效激發(fā)光斑，通過(guò)直接減小點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的半高寬來(lái)提高分辨率，包括STED，GSD等；另一種則是基于單分子定位技術(shù)，包括STORM，PALM等。前者是通過(guò)受激態(tài)或基態(tài)耗盡的方式，壓縮熒光有效發(fā)射區(qū)域；后者則是利用熒光標(biāo)記本身的開(kāi)關(guān)效應(yīng)，通過(guò)稀疏激發(fā)、分時(shí)成像、質(zhì)心定位以及圖像合成來(lái)實(shí)現(xiàn)納米分辨成像，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)20nm的橫向空間分辨率。

然而，利用單分子定位技術(shù)對(duì)直徑為10μm以上的細(xì)胞進(jìn)行納米分辨三維成像仍然存在很多問(wèn)題。首先，單分子定位對(duì)于軸向分辨率并沒(méi)有提高，常常需要結(jié)合某些改進(jìn)軸向分辨率的方法，如柱面鏡像散法、雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)法（DH-PSF）、雙層平面探測(cè)法、虛擬空間超分辨顯微術(shù)（VVSRM）等，可實(shí)現(xiàn)橫向空間分辨率達(dá)20-30nm左右，軸向分辨率達(dá)40-70nm的三維成像，目前，這些方法的成像深度只有2μm。另外，干涉光敏定位顯微技術(shù)（iPALM)可將三維的分辨率提高到20nm以?xún)?nèi)，但成像范圍僅被限制在蓋玻片以下500nm的深度范圍內(nèi)，因此，這些方法的成像深度均較小。

細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)成像要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)追蹤多個(gè)分子，這要求成像手段在三維空間以納米定位精度快速探測(cè)十幾微米景深范圍內(nèi)的多個(gè)目標(biāo)分子。目前的單分子追蹤(SPT)方法，既可以對(duì)樣品中只包含目標(biāo)分子的區(qū)域進(jìn)行局部探測(cè)，實(shí)現(xiàn)1nm精度的熒光成像（FIONA）；也可以采用寬場(chǎng)成像的方法，實(shí)現(xiàn)同時(shí)追蹤多個(gè)分子。雖然寬場(chǎng)探測(cè)的SPT方法已經(jīng)發(fā)展了圖像堆棧、離焦成像、用聚焦激光光束環(huán)繞粒子運(yùn)動(dòng)、Fresnel粒子追蹤(FPT)，以及柱面鏡像散等多種軸向分辨的方法，已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)三維的納米定位，但目前實(shí)現(xiàn)的成像深度僅僅為3μm左右，而一般完整細(xì)胞的厚度有十幾微米，因此，現(xiàn)有的方法仍不能滿(mǎn)足細(xì)胞內(nèi)多分子追蹤的大景深要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種大景深三維納米分辨成像方法，旨在解決傳統(tǒng)方法成像深度小，難以滿(mǎn)足分子定位的大景深要求的問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種大景深三維納米分辨成像方法，包括下述步驟：

創(chuàng)建具有雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和離焦光柵多階成像性質(zhì)的光學(xué)模塊；

通過(guò)所述光學(xué)模塊對(duì)待測(cè)分子進(jìn)行成像，獲得待測(cè)分子的雙螺旋圖像；

通過(guò)所述雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中點(diǎn)在成像面上的位置確定待測(cè)分子的橫向位置；

通過(guò)所述雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中心連線(xiàn)的旋轉(zhuǎn)角度及所述雙螺旋旁瓣的中點(diǎn)在成像面上的位置確定待測(cè)分子的軸向位置。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于大景深三維納米分辨成像的光學(xué)組件，包括沿光路傳輸方向依次設(shè)置的：

第一透鏡，用于將待測(cè)分子發(fā)出的熒光進(jìn)行準(zhǔn)直；

光學(xué)模塊，具有雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和離焦光柵多階成像性質(zhì)，用于將所述熒光轉(zhuǎn)換為具有雙螺旋及多階成像性質(zhì)的成像光束；

第二透鏡，用于將所述成像光束輸出以用于成像。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種大景深超分辨熒光顯微成像探測(cè)系統(tǒng)，包括沿光路傳輸方向依次設(shè)置的：

探測(cè)物鏡，用于接收含有待測(cè)分子發(fā)出的熒光的光束；

濾光片，用于對(duì)所述光束進(jìn)行濾波并輸出所述熒光；

雙色鏡，用于對(duì)所述熒光進(jìn)行反射；

管鏡，用于將反射的熒光聚焦并向成像組件輸出；

成像組件，采用上述的光學(xué)組件，用于將所述熒光轉(zhuǎn)換為具有雙螺旋及多階成像性質(zhì)的成像光束；

探測(cè)器，用于接收所述成像光束并進(jìn)行雙螺旋及多階成像。