[發(fā)明專利]靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210465877.9
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN102924606A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡風(fēng)慶;林家?guī)?/a>
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K38/16;A61P35/00;A61P7/02
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應(yīng)用，屬于微生物學(xué)，分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

2009年，美國ASCO主席在介紹腫瘤進展時提到，癌癥的第一死亡原因是癌癥本身和癌癥復(fù)發(fā)，第二位死因就是血栓。癌癥與血栓的關(guān)系非常密切，重視癌癥血栓的預(yù)防和治療已成為臨床醫(yī)生今后工作的重點之一。

1865年，法國醫(yī)生Armand?Trousseau?首次報道了胃癌患者容易形成靜脈血栓，不久，Billroth又于1878年發(fā)現(xiàn)了血栓中存在癌細(xì)胞，進一步提出癌變可引起凝血功能紊亂。臨床上把腫瘤相關(guān)性血栓稱為Trousseau綜合癥。大量的病理、實驗和臨床研究證實了這一現(xiàn)象，而且還發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的癌癥患者都存在局部或全部高凝狀態(tài)。

癌癥患者的血栓性疾病包括深靜脈血栓(deep?venous?thlmmbosis，DVT)、肺栓塞(pulmonary?embolism，PE)、彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated?intravascular?coagulation，DIC)、門靜脈血栓(portal?vein?thmrnbosis，PVT)和動脈血栓栓塞(arterial?thromboembolism，AT)、游走性淺表血栓性靜脈炎(migratory?thrombophlebitis?superficial)等，其中下肢DVT最為常見。

癌癥患者血栓形成的發(fā)病機理相當(dāng)復(fù)雜，至今尚未完全明確。多種因素通過不同途徑共同導(dǎo)致了癌癥患者的血栓易患傾向，主要包括抗癌治療、腫瘤細(xì)胞的表達(dá)物及釋放物和致癌基因等因素。

抗癌治療導(dǎo)致血栓形成，主要是手術(shù)治療期間形成血栓，化療藥物和放射治療誘發(fā)血栓形成以及患者在接受中心靜脈穿刺置管治療期間，管周纖維蛋白鞘導(dǎo)致血栓形成。

癌癥患者所患的血栓性疾病與腫瘤細(xì)胞表達(dá)和釋放的物質(zhì)關(guān)系密切。腫瘤細(xì)胞可通過釋放促凝因子或炎性因子來直接或間接地激活凝血級聯(lián)反應(yīng)，另一方面，炎性因子亦可刺激腫瘤細(xì)胞釋放更多的促凝因子而加劇血液的高凝狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞表達(dá)和釋放的三種主要促凝物質(zhì)為：組織因子（TF）、癌促凝物質(zhì)（cancer?procoagulant?CP）和絲氨酸蛋白酶（hepsin）。

新近的研究表明，某些致癌基因在促進細(xì)胞惡變的同時也能夠引起凝血功能紊亂。如Yu?J等證實，導(dǎo)致癌癥產(chǎn)生的某些基因病變?nèi)鏡as基因活化或p53基因失活能夠造成組織因子（TF）的過度表達(dá)，誘發(fā)凝血病變。

最近的研究還顯示，血栓形成參與了腫瘤的進展、血管生成和轉(zhuǎn)移等機制。除了癌癥治療形成血栓可視為外界因素外，其余兩種因素所形成的血栓都是應(yīng)機體癌變出現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，血栓的形成有利于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機制可能是纖維蛋白沉積于腫瘤細(xì)胞周圍為腫瘤生長提供了2個便利條件：一方面為腫瘤細(xì)胞附著提供了基質(zhì)，利于其局部擴散和蔓延；另一方面，纖維蛋白凝血塊和相關(guān)的凝血因子能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)（VEGF），從而為新生血管創(chuàng)造了條件。

目前，治療腫瘤及血栓的藥物都為單一功能的藥物，同時具有抗腫瘤及溶栓功能的藥物還未見報道。因此，構(gòu)建出一種既抗腫瘤又溶栓的雙功能嵌合蛋白，對于治療癌癥并發(fā)血栓的病例具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對癌癥患者易形成血栓的問題，本發(fā)明基于SEC2的抗腫瘤活性和SAK的抗血栓作用，構(gòu)建一種靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，使抗腫瘤和抗血栓兩種作用得以體現(xiàn)的同時，還具有較精確的靶向作用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：一種靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，由序列表SEQ?ID?NO.1所示的生長抑素類似物奧曲肽Oct序列、序列表SEQ?ID?NO.2所示的截短SAK氨基酸序列和序列表SEQ?ID?NO.3所示的截短SEC2氨基酸序列構(gòu)成，將三者連接在一起，得到氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示的嵌合蛋白Oct-Δsak-Δsec2或氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示的嵌合蛋白Oct-ΔSEC2-ΔSAK。

利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)上述靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白Oct-Δsak-Δsec2的方法如下：

1)????????構(gòu)建嵌合基因Oct-Δsak-Δsec2，其DNA序列如SEQ?ID?NO.9所示；