[發(fā)明專利]一種具有抗腫瘤活性的低抗凝肝素的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210464468.7
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN102924627A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 滕麗萍;陳敬華
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C08B37/10
• 分類號: C08B37/10;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種制備具有抗腫瘤活性的低抗凝肝素的方法，是以現(xiàn)有肝素為起始物進(jìn)行完全脫硫酸化肝素的制備，進(jìn)而進(jìn)行N-位重新硫酸化，在此基礎(chǔ)上采用3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸(PAPS)再生系統(tǒng)，通過AST-1V、6-OST-1和2-OST組合酶法合成特定位點(diǎn)硫酸化肝素，最后再將以上肝素衍生物進(jìn)行N-位脫硫酸化，最終得到具有低抗凝活性的專一抗腫瘤作用的肝素衍生物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：肝素鈉過氫離子交換柱得到肝素酸溶液，用三丁胺(tributylamine，TBA)將該溶液pH調(diào)至5.5左右，凍干得到肝素三丁胺鹽，將凍干粉溶于含10％甲醇的二甲亞砜溶液中，105℃，反應(yīng)12-36h，優(yōu)選為24h；醇沉，透析，脫鹽，凍干得到完全脫硫酸化肝素按質(zhì)量比1∶2逐步加入三甲基銨三氧化硫共聚物(trimethylamine?sulfur?trioxide?complex，TMA·SO3)，30-70℃，pH?9條件下反應(yīng)2-10h，優(yōu)選為55℃，pH?9條件下反應(yīng)6h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：在完全脫硫酸化肝素的基礎(chǔ)上，通過肝素生物合成酶6-OST-1和2-OST將PAPS再生系統(tǒng)中PAPS分子的活性硫酸基轉(zhuǎn)移到低抗凝血活性肝素的特定序列位置，生成低抗凝血活性而較好抗腫瘤活性的肝素衍生物；所述PAPS再生系統(tǒng)是通過AST-IV(Arylsulfotransferase?IV)的酶促反應(yīng)，由對硝基苯酚磺酸鉀鹽(PNPS)和3’-磷酸腺苷-5’-磷酸(PAP)制備PAPS，PNPS的濃度為0.1-10mM，PAP的濃度為0.1-50μM，AST-IV的用量為0.1-50mg/ml，優(yōu)選為5-10mg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：酶法硫酸化反應(yīng)條件為室溫下震蕩(300rpm)反應(yīng)1-15h，優(yōu)選為4-8h，反應(yīng)液包含50mM?Tris-HCl(pH?7.2)，1％Triton?X-100，1％BSA，1mM?MgCl₂，1mM?MnCl₂，1mM?PNPS，40μM?PAP，4mg?AST-IV，肝素生物合成酶6-OST-1或2-OST的用量為0.1-50mg/mg底物，優(yōu)選為1-20mg/mg底物。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述方法中，按照以下方法純化酶促反應(yīng)產(chǎn)物：終止反應(yīng)后，離心分離得到上清液，將此上清液與兩倍體積的緩沖液A混合，對DEAE柱上樣；依次以緩沖液A和緩沖液B進(jìn)行梯度洗脫，收集第二次洗脫所得洗脫液，得到酶促反應(yīng)產(chǎn)物；所述DEAE柱分離所用的緩沖液A為含質(zhì)量百分含量為0.5-2.5％的NaCl水溶液，緩沖液B為含質(zhì)量百分含量為2.5-5.0％的NaCl水溶液。