[發明專利]多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210464257.3
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102928606A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 陳莉莉;王穎
• 申請（專利權）人: 武漢明德生物科技有限責任公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中;牛山

技術領域

本發明屬于檢測技術領域，具體涉及一種多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒。

背景技術

1993年，Lancet首次報道降鈣素原（前降鈣素，PCT）水平在敗血癥時顯著升高，血PCT濃度大于0.5ng/ml時提示敗血癥可能，大于2ng/ml提示敗血癥的存在，大于10ng/ml則提示嚴重的膿毒敗血癥或休克，PCT可作為診斷膿毒敗血癥的特異性指標。

近年，隨著研究的深入，人們逐漸發現，細菌感染早期往往已經有PCT的低水平升高（0.1ng/ml～0.5ng/ml），PCT升高水平與細菌性感染嚴重程度及范圍有關，PCT水平大于0.25ng/ml時即建議使用抗生素治療。正常健康人群PCT水平極低（小于0.05ng/ml），非細菌性感染或炎癥（如病毒性感染，真菌性感染或自身免疫性炎癥等）往往不伴隨PCT的升高或輕微升高，因此PCT不僅能作為敗血癥的診斷指標，更廣泛應用于細菌性感染的早期診斷和鑒別診斷，指導臨床抗生素使用，并用于治療療效及預后監測。采用膠體金標記的降鈣素原檢測試劑盒有檢測快速、操作簡便的特點，但常規技術下的降鈣素原膠體金免疫層析試劑檢測靈敏度很難達到0.25ng/ml。

申請號為93118343.X（公開日：1993.8.19）的專利文件披露了一種用于實現早期檢測敗血癥并對治療進行跟蹤的方法的藥盒，該藥盒能夠測定前降鈣素含量為0.1～500ng/ml血清或血漿，進而判斷敗血癥的存在，嚴重程度以及/或者對敗血癥的治療效果；該藥盒具體包含兩種抗體：（1）一個或多個固定在載體上用以與樣品中的前降鈣素結合的第一單克隆或多克隆抗體；（2）另一攜帶標記并且與前降鈣素在不同于第一抗體的結合區域的另一區域相結合的抗體。該藥盒能夠實現的技術效果是：通過測定患者體液樣品中的肽前降鈣素和/或其形成的非完整降鈣素片斷的含量，通過測定這種確定的肽是否存在，含量的多少，得出有關是否有敗血癥，敗血癥的嚴重程度以及/或者治療效果的結論。

然而，前述專利文獻披露的技術方案存在諸多技術缺陷，本領域技術人員通過常識很明顯可以知曉，前述專利中的所謂的“一個或多個固定在載體上用以與樣品中的前降鈣結合的第一單克隆或多克隆抗體”，其本質是前降鈣素的捕獲抗體，但是，在該技術方案中，對應的標記抗體僅為一種。專利文獻在其說明書第4頁指出：本發明意義上的“前降鈣素”表示一種或多種肽；所有這些肽都包含由57個以上氨基酸組成的肽序列，特別是象完整的前降鈣素那樣的116個氨基酸序列，它們或與已知的序列一致，或者部分一致，只是在相應于前降鈣素的第108至116個氨基酸區域可能存在差異。顯然，專利文獻中所述的僅一種標記抗體是無法實現對多種“前降鈣素”片段進行有效標記的，從而無法保證盡可能多位點結合的“前降鈣素”被檢測出來，如果在此專利技術上采用膠體金、彩色磁珠等顯色劑作為標記物標記單個抗體，將導致檢測的靈敏度偏低，實踐應用效果大打折扣。

例如：來自于該專利技術的降鈣素原膠體金免疫層析試劑PCT-Q所能實現的檢測下限僅僅為0.5ng/ml，該專利為德國B.R.A.H.M.S所用，只可以滿足敗血癥的篩查診斷，而不能達到用于細菌感染診斷和指導抗生素應用的0.1ng/ml的檢測靈敏度需求；分析其原因，通過膠體金、彩色磁珠等標記抗體實現檢測，是基于膠體金、彩色磁珠具有顯色性，當一定量的膠體金或彩色磁珠通過被標記抗體與待測抗原結合后，通過待測抗原與捕獲抗體的結合使得膠體金顆粒或彩色磁珠顆粒聚集在一起，則形成肉眼可見的線條，當待測抗原濃度越高，則聚集在一起的膠體金或磁珠越多，線條的強度就越強，通過配套的儀器進行分析判讀，就可測出待測抗原的濃度。以膠體金為例，常規用于抗體標記的膠體金顆粒的直徑多在20～40nm，膠體金顆粒之間存在空間位阻，如果只是標記針對降鈣素原某一個區域的一個抗體，那么能結合在抗體上的膠體金的數量是有限的，當待測降鈣素原的濃度很低時，能夠結合的這一個標記抗體的數量也是很少的，因此即便采用多個抗體作為捕獲抗體，能夠通過標記抗體而被捕獲聚集的膠體金的數量也較少，難以形成肉眼可見的線條，因此難以達到較高的檢測靈敏度。而采用本技術方案進行不同區域的多抗體標記，待測的降鈣素原可以結合不同區域的標記抗體，那么能夠結合在降鈣素原上的膠體金顆粒更多，即便在檢測濃度很低的降鈣素原時，其能夠聚集的膠體金顆粒更多更易產生可被分析的線條，從而顯著提高檢測靈敏度。