[發(fā)明專利]基于離子液體的誘導(dǎo)結(jié)晶效應(yīng)調(diào)控溶菌酶生物活性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210464023.9
• 申請(qǐng)日: 2012-11-15
• 公開（公告）號(hào): CN103387967A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王占忠;黨樂(lè)平;肖華志;王倩;方文質(zhì)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/36
• 分類號(hào): C12N9/36
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于離子液體的誘導(dǎo)結(jié)晶效應(yīng)調(diào)控溶菌酶生物活性的方法，適用于醫(yī)藥，化工及食品領(lǐng)域溶菌酶的生產(chǎn)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

溶菌酶是一種重要的生物大分子，具有多種藥理作用，隨著生物科學(xué)的發(fā)展，溶菌酶已成為基因工程及酶工程中必不可少的工具酶，用以制造和提取菌體內(nèi)的活性物質(zhì)如核酸、酶及活性多肽等。同時(shí)它是一種天然的安全性能很好的殺菌劑、防腐劑，可廣泛應(yīng)用于食品防腐、醫(yī)藥制劑、日用化工等行業(yè)。在生產(chǎn)及純化溶菌酶過(guò)程中，由于工藝條件或環(huán)境的變化，極易造成酶的純度、構(gòu)象發(fā)生變化，甚至變性失活，進(jìn)而影響酶的生物利用度。以晶體形式存在的生物大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。結(jié)晶法是制備高純度、高活性溶菌酶的理想方法。但是，生物大分子結(jié)晶是一個(gè)復(fù)雜的理化過(guò)程，結(jié)晶過(guò)程受諸多因素的影響，包括溫度、pH值、結(jié)晶助劑的類型等，這些參數(shù)的微小變化都可能影響到結(jié)晶的進(jìn)程和結(jié)果。更為重要的是溶菌酶的相對(duì)分子質(zhì)量大，表面帶多種電荷，因此分子間相互作用或相互結(jié)合的位點(diǎn)很多，而可能形成有序排列的關(guān)鍵結(jié)合點(diǎn)和幾何匹配位置又少，在外界條件（如pH值、溫度、不同溶劑等）的影響下，分子構(gòu)象容易產(chǎn)生某些變化，構(gòu)象與構(gòu)型及超分子結(jié)構(gòu)細(xì)微變化，引起溶菌酶結(jié)晶產(chǎn)率不高，進(jìn)而影響其活性。?

目前，溶菌酶生產(chǎn)廠家主要分布在歐、美等地。其中丹麥、加拿大占世界市場(chǎng)的一半以上。我國(guó)對(duì)溶菌酶的研究、應(yīng)用起步較晚，加上國(guó)外對(duì)高純度、高活性溶菌酶的生產(chǎn)制備技術(shù)進(jìn)行了封鎖，與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，國(guó)內(nèi)對(duì)溶菌酶制造和生產(chǎn)技術(shù)相對(duì)落后，特別是高活性、高純度溶菌酶的生產(chǎn)遠(yuǎn)不能滿足我國(guó)日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。國(guó)內(nèi)一些研究者雖開展了一些有關(guān)溶菌酶提取和應(yīng)用方面的基礎(chǔ)研究工作，例如對(duì)溶菌酶結(jié)晶過(guò)程做出了簡(jiǎn)單的改進(jìn)，通過(guò)鹽析結(jié)晶等方法，使結(jié)晶產(chǎn)品產(chǎn)率有一定的提高，活性增加，但其質(zhì)量仍無(wú)法與國(guó)外產(chǎn)品相競(jìng)爭(zhēng)。?

離子液體具有蒸汽壓低、熔點(diǎn)低、液程寬、易操作、可溶性好、穩(wěn)定性高和可設(shè)計(jì)性等特性，已成為電化學(xué)、催化、有機(jī)合成中重要的反應(yīng)介質(zhì)，在化工分離中的應(yīng)用也已引起廣泛關(guān)注，目前尚未見到工業(yè)上利用添加離子液體來(lái)誘導(dǎo)溶菌酶結(jié)晶并調(diào)控溶菌酶生物活性的方法。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過(guò)誘導(dǎo)溶菌酶結(jié)晶并改善結(jié)晶過(guò)程的控制，提高結(jié)晶率的基于離子液體的誘導(dǎo)結(jié)晶效應(yīng)調(diào)控溶菌酶生物活性的方法。?

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：?

一種基于離子液體的誘導(dǎo)結(jié)晶效應(yīng)調(diào)控溶菌酶生物活性的方法，包括以下步驟：?

（1）將水溶性咪唑基離子液體加入到溶液A中，使水溶性咪唑基離子液體的質(zhì)量濃度為1%-5%，所述A溶液為pH值為4-6.5的、質(zhì)量濃度為3-6%的NaCl的乙酸鈉緩沖溶液；?

（2）將雞蛋清溶菌酶加入到步驟（1）獲得的液體中，使所述溶菌酶在20-30℃下過(guò)飽和比為1-3；?

（3）在攪拌速度為250-350rpm的條件下,將步驟（2）獲得的液體冷卻至析晶渾濁養(yǎng)晶20-40min，降溫至3-5℃并在3-5℃保持12-24小時(shí)得結(jié)晶液，將結(jié)晶液過(guò)濾，晶體在真空冷凍條件下干燥，得溶菌酶晶體產(chǎn)品，4℃低溫保藏。?

所述水溶性咪唑基離子液體為1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸、1-丁基-3甲基咪唑氯、1-丁基-3甲基咪唑溴或1，3-二甲基咪唑碘。?

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：?

（1）本發(fā)明充分利用離子液體結(jié)構(gòu)的化學(xué)可調(diào)控性和促進(jìn)生物大分子組裝的性質(zhì)，將離子液體引入到溶菌酶分離純化的結(jié)晶單元中來(lái)，通過(guò)冷卻結(jié)晶，設(shè)備簡(jiǎn)單，過(guò)程控制容易實(shí)現(xiàn)，操作方便。?

（2）本發(fā)明所使用的離子液體為水溶性離子液體，添加量少，可降低溶菌酶分子成核固液表面張力及成核自由能變，促進(jìn)溶菌酶分子在三維空間的組裝，有利于提高溶菌酶結(jié)晶率、晶體粒度及分離純化的效果。?

（3）本發(fā)明可與其它溶菌酶分離純化單元相耦合，克服結(jié)晶過(guò)程過(guò)飽和度不易控制的缺陷，降低初級(jí)成核率，提供晶體生長(zhǎng)較為均一推動(dòng)力并減少其它結(jié)晶助劑的使用，可以通過(guò)靈活改變不同離子液體的種類來(lái)調(diào)控溶菌酶的生物活性，增加其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。?

（4）本發(fā)明可降低溶菌酶結(jié)晶的較為苛刻的條件，本發(fā)明所獲得的溶菌酶晶體產(chǎn)品粒度均一，變異系數(shù)小，主粒度達(dá)到100μm以上，質(zhì)量收率92%以上，晶體外觀形貌完整，溶菌酶晶體相對(duì)活性明顯提高。?

利用離子液體誘導(dǎo)生物大分子結(jié)晶的效應(yīng)，在溶菌酶結(jié)晶單元母液中添加一定比例的離子液體，通過(guò)誘導(dǎo)溶菌酶晶體自組裝成核，改善晶體的生長(zhǎng)過(guò)程，提高溶菌酶結(jié)晶率，調(diào)控其生物活性。?

附圖說(shuō)明