[發明專利]β-Catenin基因突變的快速檢測方法

有效

• 申請號: 201210462255.0
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102925582A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 王明;范少安
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海唯源專利代理有限公司 31229
• 代理人: 王建國

技術領域：

本發明涉及生物技術和醫學領域，尤其是分子生物學，分子診斷，實時定量PCR技術。

背景技術：

β-鏈蛋白（β-Catenin；CTNNB1）是一種具有介導細胞粘附及信號傳導雙重活性的多功能的蛋白質（Bauer?and?Willert,2012），除少數游離存在于細胞漿中外，主要位于細胞膜。β-catenin蛋白的分子量約為90kDa，由約800個氨基酸組成；其分子結構主要分三個區域：氨基端可使得β-Catenin在翻譯后能保持分子穩定，羧基端則負責激活靶基因的轉錄，而另一個ARM區域因結構緊密可防止蛋白水解，是β-Catenin與其配體相互作用的基礎。β-鏈蛋白在細胞連接處與鈣粘素相互作用，參與形成粘合帶，發揮細胞粘附分子和細胞骨架成分的作用；而胞漿中游離的β-Catenin則進入細胞核而調節基因表達（Barker?et?a.,2001），即作為Wnt/β-Catenin信號通路的關鍵成員介導信號轉導過程中調控細胞的增殖和凋亡（Masiello?et?al.,2004），其異常表達或激活則能引起腫瘤發生（Chitalia?et?al.,2008）。

現有研究成果提示，β-Catenin基因發生突變時可能導致其獲得額外的功能而活化，進而引起腫瘤發生；如約85％的硬纖維瘤患者被查有β-Catenin基因突變（Lazar?et?al.,2008），其它腫瘤如結直腸癌（Morin?et?al.,1997）、卵巢癌（Sagae?et?al.,1999）、肝細胞癌（Legoix?et?al.,1999）等也都發現與β-Catenin基因體細胞突變相關。

高分辨率熔解曲線(HRM)是傳統的熔解曲線分析的延伸:它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR與專門的分析算法。使我們可以不必測序直接篩查PCR擴增產物中是否存在遺傳學變異(SNPs,mutations)。

SYBR^TM?Green?I對PCR（Polymerase?Chain?Reaction）即聚合酶鏈式反應擴增有毒性，因此必需使用低濃度的染料，又因為它是非飽和態結合，染料在熔解過程中可重新結合，使其無法適用于HRM。

羅氏開發了一種新的適用于HRM的染料ResoLight或LC?Green，它有三個優點：飽和染料毒性低；高濃度可以使DNA達到飽和；降低了染料位置重組的可能。

而PCR（Polymerase?Chain?Reaction）即聚合酶鏈式反應產物的高分辨率熔解曲線HRM的要求包括:

儀器:高分辨率高均一性的儀器，確保結果差異僅受DNA模板的影響

試劑:穩定可靠的PCR與HRM染料，確保獲取高分辨率熔解曲線

軟件:高分辨率熔解曲線分析專用軟件

羅氏熒光定量PCR系統LightCycler?Nano?System具有光源好、溫控好、檢測好、加熱快的優點，完全能滿足檢測的要求，這臺儀器也于近期通過了國家藥監局的審批，適用于臨床診斷檢測。

LightCycler?Nano?System是LightCycler?480System的縮小版，480在HRM領域發表的文獻是當前發表文獻最多的實時定量PCR系統：應用領域包括人類疾病、植物、微生物、病毒、藥理、毒理、生理、診斷等；影響因子10分以上5篇，包括Nature,Nature?Methods,NatureGenetics，影響因子5－10分10篇，5分以上文章占總數的18％逐年上升趨勢明顯，已經成為當前qPCR擴展應用的熱點目前常常使用測序法來檢測是否存在突變，但是總結下來，現有的測序法有三個缺點：

第一：靈敏度不高，低比例突變（＜20%）無法檢測；

第二：耗時長，一般需要2-3天；

第三：成本高。

鑒于以上的問題，一種靈敏度高、耗時短、成本低、可操作性能更高的實Β-CATENIN基因突變的快速檢測方法的發明是勢在必行的。

發明內容：

本發明要解決的技術問題主要是：現有的測序法有三個缺點：

第一：靈敏度不高，低比例突變（＜20%）無法檢測；

第二：耗時長，一般需要2-3天；

第三：成本高。