[發明專利]一種羧酸酯酶及其在農藥馬拉硫磷和西維因降解中的應用

有效

• 申請號: 201210461222.4
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102965355A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 黃遵錫;謝振榮;丁俊美;周峻沛;李俊俊;唐湘華;楊云娟;許波
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A62D3/02;A62D101/04;A62D101/28;A62D101/26
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體地說是一種羧酸酯酶D-1CarE3及其在農藥馬拉硫磷和西維因降解中的應用。

背景技術

????羧酸酯酶（Carboxylesterases,?E?C3.1.1.1）是一類能夠催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特異性酯酶，與脂肪酶同屬于α/β水解酶家族成員，其氨基酸序列含有Ser-Asp?-His三聯體結構，Ser，Asp，His構成了羧酸脂酶的催化活性中心（Nardini,?M,?et?al.,?Current?Opinion?in?Structural?Biology.?1999,?9(6):732-737.）。

羧酸脂酶廣泛存在于動物、植物、微生物中(Melloney?J.,?et?al.,?Journal?of?Molecular?Catalysis?B:?Enzymatic.?2005,?32:261-270.)，其中微生物來源的羧酸酯酶是一種重要的工業酶類，在催化酯水解、酯合成、酯交換等上有重要應用價值，具有良好的區域選擇性和立體選擇性（Ramos?Tombo,?et?al.,?Agricultural?and?Biological?Chemistry.?1987,?51:1833-1838.）。這些獨特性質使羧酸酯酶在食品、化工、制藥、能源開發和環境保護等領域具有廣闊的應用前景（Jaeger?K.E.,?et?al.,?Trends?in?Biotechnology.?1998,?16(9):396-403.）。

當前農業生產中，70%使用的農藥是有機磷農藥，而70%的有機磷農藥又是高毒農藥，這些農藥的使用很容易在農產品中殘留，進而影響到人的健康。本文研究的羧酸酯酶是一種重要的農藥降解酶，其對含有羧酸酯鍵的有機磷化合物，如馬拉硫磷，羧酸酯酶靠活性中心絲氨酸的可逆酰化作用來完成降解。這個酰化作用釋放出一個醇部分和一個對應的共價酰化酶。這個酰化的中間體由于水的親核作用釋放出對應的羧酸部分和有活性的酶，它可以重新來催化新一輪的降解反應。

利用微生物降解農藥殘留大多數是依靠胞內酶的酶解作用，但由于野生菌株產酶能力有限、發酵周期長、純化復雜、難以大量生產，生產成本高，限制了其推廣應用。利用分子生物學手段構建高效生物反應器，可以提高羧酸酯酶的表達量，實現其大規模工業化生產。本文從嗜熱脂環酸芽孢桿菌D-1基因組中克隆羧酸脂酶基因D-1CarE3與表達載體pET28a(+)連接后，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達并對羧酸酯酶酶學性質及羧酸酯酶對農藥馬拉硫磷和西維因的降解活性進行了初步研究，為進一步探索羧酸酯酶的應用奠定了理論基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種羧酸酯酶D-1CarE3。

本發明的再一目的是提供編碼上述羧酸酯酶的基因D-1CarE3。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

本發明的最后一個目的是提供上述羧酸酯酶D-1CarE3在馬拉硫磷和西維因的降解中的應用。

本發明所述羧酸酯酶D-1CarE3可得自嗜熱脂環芽孢桿菌（thermophilic?Alicyclobacillus?tengchongensisstrain?CGMCC1504）。D-1CarE3的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明的羧酸酯酶D-1CarE3總共含有513個氨基酸，理論分子量為56.01?kDa，理論等電點為5.69。以β-乙酸萘酯為底物：該酶作用的最適溫度65?℃；最適pH7.0；終濃度1?mM的金屬離子K⁺和Pb²⁺對酶有激活作用，Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Hg²⁺和Mn²⁺等有抑制作用；?在溫度37?℃保溫50?min，仍能保持70%以上的活性；經1/15?mol/L?pH7.0緩沖液下處理50?min，仍能保持50%以上的活性；酶液在室溫（23?℃）放置5?d，仍有27%以上的活性。

本發明提供了編碼上述羧酸酯酶的基因D-1CarE3，該基因序列如SEQ?ID?NO.2。