[發明專利]酵母中自組裝的具有免疫原性的腸道病毒病毒樣顆粒的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201210459267.8
• 申請日: 2012-11-15
• 公開（公告）號: CN102925476A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 陳榮;李浩洋;呂柯;何婭玲
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N7/04;A61K39/125;A61P31/14;C12R1/865
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 金重慶

1.一種制備腸道病毒病毒樣顆粒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（a）優化P1基因，構建表達P1蛋白的pYES2載體重組子；?

（b）構建具有色氨酸缺陷互補基因且敲除Ura缺陷互補基因的改造載體pYES2-Trp，優化3CD基因，構建表達3CD蛋白的pYES2-Trp載體重組子；

（c）將步驟（a）和步驟（b）中構建的載體重組子共同轉化進入釀酒酵母表達菌株，酵母培養發酵；

（d）將步驟（c）中培養的酵母進行破碎、純化和鑒定，即得腸道病毒病毒樣顆粒，所述的腸道病毒病毒樣顆粒由VP0、VP1、VP3三種蛋白單體組成。

2.根據權利要求1所述的制備腸道病毒病毒樣顆粒的方法，其特征在于，所述的步驟（c）中酵母發酵誘導培養基為YPG培養基，誘導表達的菌液初始濃度為1OD，收菌濃度為5OD。

3.根據權利要求1所述的制備腸道病毒病毒樣顆粒的方法，其特征在于，所述的腸道病毒為EV71病毒，包括以下步驟：

（a）構建表達EV71-P1蛋白的pYES2載體重組子：使用引物SEQ?ID?NO.3、引物SEQ?ID?NO.4，以基因合成產物SEQ?ID?NO.11作為模板，通過PCR的方法擴增得到密碼子優化后的EV71-P1基因片段，并對該擴增片段及pYES2載體分別進行XhoI/XbaI雙酶切處理，對兩者進行連接處理后，得到可以表達EV71-P1蛋白的pYES2載體重組子pYES2-EV71-P1；

（b）構建具有色氨酸缺陷互補基因且敲除Ura缺陷互補基因的改造載體pYES2-Trp，構建表達EV71-3CD蛋白的pYES2-Trp載體重組子：使用引物SEQ?ID?NO.5、引物SEQ?ID?NO.6以基因合成產物SEQ?ID?NO.12作為模板，通過PCR的方法擴增得到優化后的EV71-3CD基因片段，并對該擴增片段及pYES2-Trp載體分別進行BamHI/SphI雙酶切處理，對兩者進行連接處理后，得到可以表達EV71-3CD蛋白的pYES2-Trp載體重組子pYES2-Trp-EV71-3CD；

（c）將步驟（a）和步驟（b）中得到的重組子pYES2-EV71-P1和pYES2-Trp-EV71-3CD共同轉化進入釀酒酵母表達菌株，酵母培養發酵；

（d）將步驟（c）中培養的酵母進行破碎、純化和鑒定，即得所述的病毒樣顆粒。

4.根據權利要求1所述的制備腸道病毒病毒樣顆粒的方法，其特征在于，所述的腸道病毒為CVA16病毒，所述的方法包括以下步驟：

（a）構建表達CVA16-P1蛋白的pYES2載體重組子：對基因合成產物SEQ?ID?NO.13及pYES2載體分別進行XhoI/XbaI雙酶切處理，對兩者進行連接處理后，得到可以表達CVA16-P1蛋白的pYES2載體重組子pYES2-CVA16-P1；

（b）構建具有色氨酸缺陷互補基因且敲除Ura缺陷互補基因的改造載體pYES2-Trp，構建表達CVA16-3CD蛋白的pYES2-Trp載體重組子：使用引物SEQ?ID?NO.7、引物SEQ?ID?NO.8，以CVA16病毒cDNA作為模板，通過PCR的方法擴增得到CVA16-3CD基因片段，并對該擴增片段及pYES2-Trp載體分別進行BamHI/SphI雙酶切處理，對兩者進行連接處理后，得到可以表達CVA16-3CD蛋白的pYES2-Trp載體重組子pYES2-Trp-CVA16-3CD；

（c）將步驟（a）和步驟（b）中得到的重組子pYES2-CVA16-P1和pYES2-Trp-CVA16-3CD共同轉化進入釀酒酵母表達菌株，酵母培養發酵；

（d）將步驟（c）中培養的酵母進行破碎、純化和鑒定，即得所述的病毒樣顆粒。

5.根據權利要求1-4任一所述的方法制備得到的腸道病毒病毒樣顆粒。

6.根據權利要求5所述的腸道病毒病毒樣顆粒在制備預防腸道病毒感染疾病的疫苗中的應用。

7.一種具有免疫原性的組合物，其特征在于，包括權利要求5所述的病毒樣顆粒和藥學上可接受的載體。