[發明專利]一種檢測自身免疫疾病相關抗核抗體譜的試劑盒

有效

• 申請號: 201210456019.8
• 申請日: 2012-11-14
• 公開（公告）號: CN102937648A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 李想;周帥;何濤濤;陳洪;鄭麗;陳衛;陳川
• 申請（專利權）人: 四川省新成生物科技有限責任公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 譚新民

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種診斷疾病的試劑盒，具體地，涉及一種檢測自身免疫疾病相關抗核抗體譜的試劑盒。

背景技術

自身免疫是機體免疫系統對自身抗原發生反應，產生自身抗體和自身應答T細胞。在正常生理狀態下，自身免疫可以及時清除衰老死亡的自身細胞，維持內環境的穩定。在某些病理的狀態下，可能會產生直接和間接的破壞自身組織的自身應答性T細胞和自身抗體，并引起相應器官組織的病變和功能障礙，稱為自身免疫性疾病（Autoimmune?disease?,AID）。常見的自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、系統性硬化癥、多發性皮炎/肌炎、混合性結締組織病、甲狀腺機能亢進、青少年糖尿病、原發性血小板紫癜、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結腸炎以及許多種皮膚病、慢性肝病等。

AID的臨床表現復雜多變，在臨床上常造成漏診和誤診；疾病常慢性遷延，進行性加劇，最后造成不可逆的器質性或功能損害，嚴重影響患者的生活質量，甚至危及生命。而AID的早期診斷和治療將顯著的控制病情發展，使病人的生活質量顯著提高，可像正常人一樣生活。

自身抗體檢測對與自身免疫疾病的診斷和治療監測都有重要意義，很多自身抗體已經被寫入了AID診斷的國際標準，其中最重要的是抗核抗體（antinuclear?antibodies，?ANA）。ANA是抗細胞核抗原成分的自身抗體的總稱，本專利包含了常見抗核抗體的靶成分共17種：dsDNA、核小體、SmD1、核糖體P0蛋白、組蛋白、U1?snRNP、Ro/SS-A(52KD)、Ro/SS-A(60?KD)、La/SS-B、Scl-70、CENP-B、Jo-1、AMA-M2、PM-Scl、PCNA、Mi-2和Ku。這些自身抗體均是常見的有明確臨床意義的。目前國內外還沒有同時檢測17種抗核抗體的診斷試劑。

對于自身免疫疾病診斷方法多采用間接免疫熒光分析法（IFA）、酶聯免疫吸附法〔ELISA)和免疫印跡，但各有其不足。間接免疫熒光分析法是檢測自身抗體的常用技術。其實驗基質為Hep-2細胞或不同靈長類肝臟組織冰凍切片，含有完整的抗原譜，適合篩查試驗。但是有如下缺點：不能作為確診依據；結果的判斷需要有豐富的經驗；滴度的意義大于核型，但滴度的判定主觀性強；靈敏度較低，特異性也不高。

酶聯免疫吸附法(ELISA)具有靈敏度高，可作為篩選實驗，也可作為確診依據，還可定量測定，檢測病情和治療效果。但一次試驗只能檢測單一指標，通量低，檢測成本較高，在自身免疫疾病的診斷應用推廣方面存在著極大的局限性。Western?blot（WB）是在凝膠電泳和免疫分析技術基礎上發展起來的一種免疫檢測技術，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性的優點，比較適合發現未知的抗體。而對于檢測已知的抗體，由于使用了天然的混合抗原，實驗過程中經常出現找不到目標條帶和條帶偏移的問題，給結果的判讀造成了不少困難，極易誤判和漏判。同時WB使用時間長，也不適合在臨床檢驗中推廣。有人將WB改進，直接將純化抗原包被于硝酸纖維素膜上，然后進行免疫反應檢測抗體，形成了改良的免疫印跡方法。目前已有同時檢測15個自身抗體的膜條，通過將純化抗原平行包被到硝酸纖維膜，封閉非特異性反應區。在第一次溫育時，已稀釋的血清與檢測膜條反應，不同的樣本或質控在不同的孵育槽間進行。如果樣本陽性，特異性的IgG（也包括IgA和IgM）與相應抗原結合。為檢測已結合的抗體，加入酶標抗人IgG（酶結合物）進行第二次溫育，然后加入酶底物，孵育顯色，加入終止液，結果判讀。優點是可實現高通量的檢測，由于使用了純化抗原，特異性和靈敏度比傳統的Western?blot高了不少。

對于現有的試劑盒，存在下述缺點：

1、所檢測的抗體僅有15個，并且某些抗原為早期研究的成果，目前已有新的更有意義的靶抗原。

2、所使用的純化抗原多為從天然組織中提取，純度的不足（≥90%）依然影響了檢測的靈敏度和特異性。

3、膜條背景深，有時比陽性條帶還要深，影響了結果的可靠性。

4、不同的抗原條帶寬度不一，條帶間隔不一，影響了結果的準確判讀。

5、同類產品如CN200810132304.8公開的試劑盒，沒有臨界質控帶，結果的判讀需要另做一個對照膜條，增加了實驗的成本，同時由于槽與槽之間反應環境存在一定的差異，可能造成假陽性或假陰性。目前有的相關產品也有臨界質控帶，但一條質控帶只能對一個檢測條帶或項目的結果進行判讀，目前尚沒有用一個臨界質控帶同時對兩個乃至更多的條帶進行判讀的應用。

發明內容