[發(fā)明專利]抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210455749.6
• 申請日: 2012-11-12
• 公開（公告）號: CN102911972A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭天凌;安新麗;張化俊;傅麗君;李東
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12R1/13
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森;劉勇

1.抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺的制備方法，其特征在于所述二異丁氧基苯基胺的分子式為C₁₀H₁₅NO；

所述抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺的制備方法，包括以下步驟：

1）將短桿菌（Brevibacterium?sp.）BS01純化后接種于新鮮海水配制的固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)；挑取所述固體培養(yǎng)基平板上的單菌落接種于新鮮海水配制的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；所述短桿菌（Brevibacterium?sp.）BS01保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCC?No.6481；

2）將步驟1）所得的發(fā)酵液離心后加入萃取劑萃取，將乙酸乙酯萃取相合并得到萃取物A，將萃取物A旋轉(zhuǎn)蒸干，再加入甲醇溶解離心，去鹽，去蛋白，得到粗提物A；

3）將步驟2）所得的粗提物A溶于萃取劑中，然后上樣于硅膠柱，采用流動相梯度濃度洗脫，在洗脫過程中，間隔收集洗脫液，并將洗脫液進(jìn)行層析，采用紫外顯色、碘蒸氣顯色和硫酸銨乙醇顯色，然后合并相似組分，得到合并洗脫液；

4）將在步驟3）所得的合并洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下真空蒸干，然后溶解于DMSO進(jìn)行抑藻活性驗(yàn)證，選取經(jīng)驗(yàn)證后具有抑藻活性組分的粗提物B；

5）將步驟4）所得的粗提物B采用葡聚糖凝膠柱進(jìn)一步分離，得到洗脫液；

6）將步驟5）得到的洗脫液進(jìn)行層析分析，采用紫外顯色、碘蒸氣顯色和硫酸銨乙醇顯色，然后合并相似組分，得到合并洗脫液，然后將合并洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空蒸干，再溶解于DMSO驗(yàn)證抑藻活性，選取經(jīng)驗(yàn)證后具有抑藻活性組分的活性物C；

7）將步驟6）所得的活性物C，經(jīng)薄層層析（thin-layer?chromatography，TLC）分析檢測，并經(jīng)¹H-NMR質(zhì)譜檢測，得到純化合物，該純化合物即為本發(fā)明所述的抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺。

2.如權(quán)利要求1所述的抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺的制備方法，其特征在于在步驟1）中，所述固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)是置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；所述恒溫培養(yǎng)箱的溫度為25～32℃；所述液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)可通過搖床培養(yǎng)3～5d，所述搖床的溫度可為28～37℃，所述搖床的轉(zhuǎn)速可為180～250rpm。

3.如權(quán)利要求1所述的抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺的制備方法，其特征在于在步驟1）中，所述固體培養(yǎng)基采用2216E固體培養(yǎng)基；所述液體培養(yǎng)基采用2216E液體培養(yǎng)基。

4.如權(quán)利要求1所述的抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺的制備方法，其特征在于在步驟2）中，所述離心采用離心機(jī)離心，離心力為10,000～12,000g，離心時(shí)間為10～20min；所述萃取劑的加入量按體積比可與發(fā)酵液等體積。

5.如權(quán)利要求1所述的抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺的制備方法，其特征在于在步驟2）中，所述萃取劑采用乙酸乙酯，所述萃取的次數(shù)可為5次；所述旋轉(zhuǎn)蒸干可采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸干。

6.如權(quán)利要求1所述的抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺的制備方法，其特征在于在步驟3）中，所述萃取劑采用乙酸乙酯；所述硅膠柱的規(guī)格為170×30mm，200～300目。

7.如權(quán)利要求1所述的抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺的制備方法，其特征在于在步驟3）中，所述流動相梯度濃度洗脫最好依次經(jīng)過以下（a）～（h）8個(gè)洗脫過程：（a）采用石油醚洗脫2～2.5個(gè)柱體積；（b）采用石油醚和乙酸乙酯洗脫，按體積比，石油醚∶乙酸乙酯=4∶0.5，總體積1.5個(gè)柱體積；（c）采用石油醚和乙酸乙酯洗脫，按體積比，石油醚∶乙酸乙酯=4∶1.5，總體積1.5個(gè)柱體積；（d）采用石油醚和乙酸乙酯洗脫，按體積比，石油醚∶乙酸乙酯=4∶2.5,總體積1.5個(gè)柱體積；（e）采用石油醚和乙酸乙酯洗脫，按體積比，石油醚∶乙酸乙酯=4∶3.5,總體積1.5個(gè)柱體積；（f）采用乙酸乙酯洗脫1.5個(gè)柱體積；（g）乙酸乙酯甲醇洗脫，按體積比，乙酸乙酯∶甲醇=25∶1，總體積2個(gè)柱體積；（h）采用甲醇洗脫2個(gè)柱體積；所述間隔收集洗脫液的間隔時(shí)間可為10～15min；所述層析可采用薄層層析分析方法進(jìn)行層析。

8.如權(quán)利要求1所述的抑藻活性物質(zhì)二異丁氧基苯基胺的制備方法，其特征在于在步驟4）中，所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空蒸干的溫度為28～32℃。