[發明專利]一種由枯草芽孢桿菌J18分離純化的抗菌蛋白、蛋白制品、制備方法及應用

無效

• 申請號: 201210454833.6
• 申請日: 2012-11-14
• 公開（公告）號: CN103045704A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 宋水山;宋聰;賈振華;黃亞麗;馬宏;李惠榮
• 申請（專利權）人: 河北省科學院生物研究所
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/30;A23B7/16;D21H21/14;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/125
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 朱江嶺

技術領域

本發明涉及一種由枯草芽孢桿菌J18分離純化的抗菌蛋白、蛋白制品、制備方法及應用。?

背景技術

目前，我國水果采后腐爛損失嚴重，造成了巨大經濟損失。采后病原微生物的侵染是造成采后腐爛損失的最主要原因。但是在水果保鮮中大量使用化學殺菌劑給水果的食用安全造成了很大的影響，如何減少水果保鮮中化學殺菌劑的使用成為公眾十分關注的食品安全問題。?

枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis(Ehrenberg)Cohn是自然界中廣泛的一種非致病細菌,能夠分泌多種抗菌物質，其中抗菌蛋白或抗菌肽具有抑菌廣譜性和高效性，對環境無污染、對人畜無毒無害、不產生抗藥性等優點，在研究開發新型生物農藥制劑中有廣闊的利用價值。目前市場上的生物農藥主要是以活菌體生物制劑為主，其在使用時常出現見效緩慢、防效也不穩定、易受紫外線影響等現象，并且在儲藏過程中有效期較短，對儲藏環境要求嚴格等。而抗菌蛋白或抗菌肽等生物農藥則避免了外界環境對活菌體保存產生的影響，并且防效穩定、見效快。因此，抗菌蛋白或抗菌肽生物生物制劑比活菌體制劑更具有優勢和應用前景?？咕鞍谆蚩咕牡难芯窟€能夠為抗菌蛋白基因的克隆、轉基因工程菌的構建，以及培育新的抗病品種打下良好的基礎。?

李智洋等利用硫酸銨沉淀法從枯草芽孢桿菌代謝物中沉淀出抗軟腐菌的抗菌蛋白。黃保全等利用硫酸銨沉淀、疏水層析、陰離子交換層析等方法從枯草芽孢桿菌E1R-j發酵液中分離純化出抗菌蛋白j1。San-Lang?Wang等也從枯草芽?孢桿菌W-18中提取出幾丁質酶，分子量為20.6kD，能夠強烈抑制Fusariumoxysporum生長的作用。Wiehitra?L.等從枯草芽孢桿菌NSRS89-24中分離純化出β-1,3-葡聚糖酶，β-1,3-葡聚糖酶可以催化β-1,3-葡聚糖多聚體水解，而達到抑制真菌生長的目的。?

發明內容

本發明為解決現在技術中的問題，提供一種由枯草芽孢桿菌J18分離純化的抗菌蛋白、蛋白制品、制備方法及應用，它對果實和農作物病害也都有顯著的防治效果，是一種廣譜高效的蛋白制品。?

本發明采用以下技術方案予以實現：?

所述枯草芽孢桿菌J18菌種編號為CGMCC?No.3665，菌種名稱：枯草芽孢桿菌（Bacillus?substilis）J18。?

本發明一種由枯草芽孢桿菌J18分離純化的抗菌蛋白的制備方法，它包括以下步驟；?

J18抗菌蛋白的制備；?

種子活化：將枯草芽孢桿菌J18菌株從保存的甘油菌轉接于LB液體培養基中，于30℃、150-250rpm培養18h，得J18菌懸液；取培養好的菌懸液稀釋，均勻涂布到LB固體平板培養基中，于25℃培養箱培養48h后，用牙簽挑單菌落再次接種于LB液體培養基試管中，于30℃、150-250rpm培養過夜，取5mL培養好的菌懸液轉接到裝有150mL?LB液體培養基的500mL三角瓶中置搖床30℃振蕩培養，轉速為150-250rpm；得活化的菌懸液。?

種子培養:將活化的菌懸液接種到LB液體培養基中，150-250r/min，30℃搖床培養16h。?

發酵培養:使用30L發酵罐進行分批發酵；裝料系數0.6(18L)，接種量5%，發酵溫度30℃，通氣量0.5m3/h，攪拌轉速150-250r/min，溶氧(DO)保持在75%左右，流加食用豆油消泡，pH?6.8~7.2，不流加調節pH值的酸堿性物質。?

發酵培養基配方為淀粉3g、蔗糖5g、硫酸錳30.8mg/kg的溶液2mL、磷酸?氫二鉀3g、磷酸二氫鉀1.5g、豆粕30g，水1000mL。?

發酵周期:34±2h。?

取菌株J18發酵上清液經0.22μm孔徑的細菌過濾器過濾制成無菌濾液；取無菌濾液，采用(NH4)2SO4沉淀法提取，在硫酸銨梯度40-70%下，4℃下沉淀過夜，8,000r/min離心20min，沉淀用0.05mol/L磷酸緩沖液(pH?7.0)懸浮，SepherdexG-25層析除鹽，真空冷凍干燥，獲得J18抗菌蛋白。?

所述LB液體培養基的組分為：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g和水1000mL。?

所述LB固體平板培養基的組分為：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g和水1000mL。?

使用上述制備的J18抗菌蛋白制備的蛋白制品，所述蛋白制品為被膜劑或抗菌保鮮紙。?

所述被膜劑的制備方法包括以下步驟：?