[發明專利]多角體基因前120bp片段及其應用

有效

• 申請號: 201210453287.4
• 申請日: 2012-11-13
• 公開（公告）號: CN102952806A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 張耀洲;耿文杰;舒特俊;陳劍清
• 申請（專利權）人: 天津耀宇生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

技術領域

?本發明涉及對一種多角體基因前120bp片段及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

大腸桿菌表達系統目前是應用最廣泛的蛋白表達系統之一，其具有成本低廉、生產率高、操作簡單等優點。該系統主要有表達載體、表達宿主菌、表達條件等組成。目前，越來越多的研究人員關注于融合表達載體的應用，研究成功的融合表達載體主要有：GST?(谷光甘肽-S-轉移酶)?系統、半乳糖苷酶系統、麥芽糖結合蛋白(MBP)?系統、蛋白A系統、純化標簽融合系統等。

家蠶(Bombyx?mori)多角體蛋白(Polyhedrin，Polh)基因共有738個核苷酸，編碼由245個氨基酸組成的大小為29?kD的多肽。它是多角體的主要結構成份；多角體蛋白構成的蛋白質晶體對包埋在其中的病毒體具有保護作用，它使病毒體在自然環境中保持穩定和侵染能力。多角體蛋白基因polh是一個超表達極晚期基因。在病毒感染的晚期，當其它病毒基因和宿主基因關閉后，此基因能持續高水平表達，在受感染細胞內產生的多角體蛋白的量可達細胞蛋白質總量的25％-50％。近20年來，人們都致力于研究多角體蛋白基因的高效表達機制，并且利用它的這種特性使許多外源基因得到了高效表達，尤其是一些難以表達的蛋白例如膜蛋白。家蠶核型多角體病毒的多角體蛋白具有它獨特的性質，在大腸桿菌中表達的多角體蛋白在中性pH條件下以包涵體的形式存在，只有在堿性條件(pH?10.8及以上)下可溶，并且這種多角體蛋白具有與天然多角體蛋白晶體相同的性質。因此，可將目的蛋白基因與其融合表達，一方面能提高目的蛋白的表達量，另一方面，通過簡單的pH梯度洗脫和差速離心的方法就可以獲得較純的融合蛋白，再經過特異性蛋白酶酶切消化，回收得到較純的目的蛋白。張耀洲等在純化標簽融合系統上進行改造，將具有高效表達的能力多角體蛋白作為一種標簽，將不表達或者難表達的蛋白基因融合上去，從而使其表達或者提高其表達量。同時，利用多角體的溶解特性，通過簡單的pH調節和差速離心的方法得到比較純的融合蛋白，之后進行蛋白酶切得到純的目的蛋白。但是，蛋白酶的最佳作用pH范圍在7.0-8.5，而多角體蛋白只有在pH10.8時才會溶解，所以在這一條件下進行酶切時，蛋白酶喪失活性或者無法達到最大活性，所得到的目的蛋白的量也受到限制。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種多角體基因前120bp片段及其應用。本發明通過在常用載體的基礎上，插入該多角體蛋白基因前120bp片段，后面可繼續克隆上外源基因，用于融合表達；表達出來的融合蛋白，可用調節PH值的方法等進行快速純化該目的蛋白，還能在低pH值(pH7.6)下溶解，所溶解的pH值符合一般蛋白酶反應需要的條件。

本發明的技術方案如下：

本發明提供一種多角體基因前120bp片段，其堿基序列如SEQ?ID?NO:1所示。

本發明還提供上述多角體基因前120bp片段在表達融合蛋白及降低其溶解性中的應用。

本發明還提供上述多角體基因前120bp片段與蛋白酶酶切位點連接而成的重組基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO:2所示。

進一步地，其中所述蛋白酶為凝血酶。

本發明還提供一種含上述多角體基因前120bp片段的重組載體。

進一步地，其中所述重組載體由多角體基因前120bp片段與轉移載體構建而成。

進一步地，其中所述轉移載體為?pET22b、pET28a、pET28b、pET28c、pET32a、pcDNA3或pFastBac^?TM。

進一步地，其中所述轉移載體為pET28a。

本發明進一步提供一種含上述多角體基因前120bp片段的基因工程菌。

進一步地，其中所述基因工程菌為大腸桿菌。

本發明主要是在常用的表達載體中利用多角體基因前120bp片段(polh120)和外源基因EGFP進行融合表達，同時與全長多角體融合方式比對。本發明中的融合方式在具有全長多角體性質的同時，還降低了溶解融合蛋白所需溶液的pH值，使融合蛋白在中性緩沖液中即可溶解，并適用于蛋白酶等酶切反應的進行。

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附圖說明

圖1是本發明構建的重組表達載體的質粒圖；

圖2是本發明多角體基因前120bp片段的PCR產物電泳圖；其中，M:核酸分子量標準；1：目的基因PCR產物；?