[發明專利]一種家蠶天然免疫蛋白Hemolin及其純化方法

有效

• 申請號: 201210452712.8
• 申請日: 2012-11-12
• 公開（公告）號: CN102977200A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 張耀洲;杜瑤瑤;劉玲玲;陳劍清;舒特俊
• 申請（專利權）人: 天津耀宇生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

技術領域

本發明涉及一種家蠶天然免疫蛋白Hemolin及其純化方法，屬于蛋白質技術領域。

背景技術

Hemolin作為昆蟲所特有的一種防御蛋白，在研究昆蟲的免疫機制中有重要的意義。目前對其結構和功能的研究都取得了一定的成果，但是對其在體外的功能研究較少，所以本實驗通過簡單的純化得到較純的Hemolin，進一步研究該蛋白的結構和功能奠定基礎，也可以在此基礎上對它的結構做更深入的探索。

因為基因工程產品的組分復雜、對產品的純度要求較高且蛋白在純化過程中存在聚集變性的趨勢，所以它的制備和純化比一般產品要困難的多。雖然人們普遍使用制備型HPLC進行基因工程產物的最后一步純化，但由于HPLC?具有對軟硬件的要求較高，前期投入大，純化量有限，價格昂貴，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多等缺點。而Superdex?75蛋白純化系統具有純化量大、流速快，負載量較大，層析條件易控制，非特異性吸附小等優點。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供一種家蠶天然免疫蛋白Hemolin及其純化方法，該方法以家蠶桿狀病毒感染的蠶蛹為原料，通過多種離心方法得到含有天然免疫蛋白的溶液；將母液進行活性測定后，將活性高的母液脫糖，脫糖溶液與母液按10:1比例通過宏吸的方法過300K膜包去除糖分；將去糖的母液與蛋白提取液按1:2.5混合，在4℃冰箱中緩慢攪拌過夜；之后通過弱陰離子交換柱(DEAE)初步分離，再通過瓊脂糖凝膠柱(SuperdexTM?200?、SuperdexTM?75?)進一步純化。

為達到上述目的，本發明提供一種家蠶天然免疫蛋白Hemolin，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

上述家蠶天然免疫蛋白Hemolin的純化方法，包括以下步驟：

(1)家蠶免疫蛋白母液的制備；

(2)家蠶天然免疫蛋白的分離純化。

進一步地，其中步驟(1)中所述家蠶免疫蛋白母液的制備具體包括：

a.保存于-20℃的蠶蛹與4℃預冷的滅菌ddH₂O以1:3的重量百分比混合在冰上勻漿2?min，將勻漿液置于冰上停留5?min，重復9次；

b.于15000?rpm，4℃離心60?min，重復5次，最后一次用4層紗布過濾；

c.過濾后的上清液取200mL與水按1:1的體積混合，用0.22μm膜包過濾，重復10次，上清溶液恢復到200mL的體積；

d.?步驟c所得上清液于50000rpm，10℃離心40min后，出現的黑團用超濾液重懸進行區帶離心；取樣品300ml進行蔗糖密度梯度離心3h;

e.將步驟d?離心3h后所得的上清液用質量體積濃度為60%的蔗糖溶液下樣，按35mL/管收集，并在每管中取3mL做比活測定。

進一步地，其中步驟d中所述樣品的蔗糖密度梯度離心為：鋪制pH?7.4的磷酸鹽緩沖液?200ml，樣品300ml，30%蔗糖400ml，55%蔗糖充滿，22000rpm密度梯度離心3h。

進一步地，其中步驟d中所述區帶離心的條件為：50000rpm，10℃離心40min；樣品為步驟c所得上清液；蔗糖濃度為質量體積濃度。

進一步地，其中步驟d中所述pH?7.4的磷酸鹽緩沖液的制備方法為：將8g?NaCl、0.2g?KCl、3.58g?Na₂HPO₄·12H₂O、0.27g?KH₂PO₄溶于800mL無菌去離子水中，定容至1000mL即得。

?

進一步地，其中步驟(2)中所述家蠶天然免疫蛋白的分離純化具體包括：

a.將活性高于26的母液與脫糖組分按1:10的體積比例通過宏吸的方法，過300K膜包去除糖分；?

b.將去糖的母液與蛋白提取液按1:2.5的體積比混合，在4℃冰箱中緩慢攪拌過夜；

c.之后通過弱陰離子交換柱DEAE初步分離，將分離所得的溶液用100kD的超濾管進行濃縮；

d.瓊脂糖凝膠柱分離，得到8個峰，并將每個不同的峰分批濃縮；

e.濃縮含目的蛋白的峰，用瓊脂糖凝膠柱進一步純化得到目的蛋白，并用SDS-PAGE鑒定。

進一步地，其中步驟(d)中所述瓊脂糖凝膠柱為SuperdexTM?200凝膠柱。

進一步地，其中步驟(e)中所述瓊脂糖凝膠柱為SuperdexTM?75凝膠柱。