[發明專利]評價卷煙主流煙氣減害效果以及安全性的化學生物學方法

有效

• 申請號: 201210452637.5
• 申請日: 2012-11-13
• 公開（公告）號: CN103014115A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 李冉;羅誠浩;魏敏;宋旭艷;陳義坤
• 申請（專利權）人: 湖北中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12R1/19;C12R1/445;C12R1/725;C12R1/865;C12R1/25;C12R1/90
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 馬輝

1.一種卷煙減害效果以及自身安全性評價的生物熱化學方法，包括以下步驟：

1）選擇模式研究對象，配置相應的培養基：

⑴大腸桿菌：LB培養基用于培養及測試，LB培養基配方為5g酵母粉，10g蛋白胨，5g的NaCl溶于1L二次蒸餾水中，調節pH至7.4，在120℃、

1.034×105Pa高壓滅菌處理20min，待用；

⑵金黃色葡萄球菌：LB培養基用于培養及測試；

⑶白色假絲酵母菌：LB培養基用于培養及測試；

⑷釀酒酵母菌：YPDA培養基用于培養及測試，YPDA培養基配方為20g蛋白胨、10g酵母抽提物、2g葡萄糖用適量二次蒸餾水溶解，再加入15?ml的0.2%腺嘌呤溶液，定容到1L，120℃高壓滅菌15min，室溫貯存，待用；

⑸植物乳桿菌：乳酸菌培養基用于其培養和測試，培養基配方為將7.5g酵母粉、7.5g蛋白胨、10g葡萄糖、2g的KH₂PO₄、0.5ml吐溫80溶于900ml二次蒸餾水，再加入100ml番茄汁，混勻后低溫貯存，待用；

⑹嗜鹽古生菌：嗜鹽古生菌培養基用于培養及測試，嗜鹽古生菌培養基配方為：250g的NaCl，2g的K₂SO₄，30g的MgCl₂·6H₂O，2g酵母提取物，2.5g水解乳蛋白，溶于1L二次蒸餾水中，待用；

⑺四膜蟲：四膜蟲培養基用于培養及測試，：四膜蟲培養基配方為15g蛋白胨、5g酵母粉、1g葡萄糖溶解于1L蒸餾水中，pH?值調至7.0~7.5，高壓滅菌后待用；

⑻成纖維細胞：成纖維細胞培養基用于培養及測試，成纖維細胞培養基配方為MEM基礎培養基，加入10%胎牛血清和0~0.4g·L^-1的非必需氨基酸；MEM培養基基本成分為0.20g·L^-1無水CaCl₂、0.0977g·L^-1無水MgSO₄、0.40g·L^-1?KCl、6.8g·L^-1?NaCl、0.122g·L^-1?NaH₂PO₄、0~0.001g·L^-1酒石酸膽堿、0~0.001g·L^-1葉酸、0~0.002g·L^-1肌醇、0~0.001g·L^-1煙酰胺、0~0.001g·L^-1D-泛酸鈣、0~0.001g·L^-1鹽酸吡哆辛、0~0.0001g·L^-1核黃素、0~0.001g·L^-1鹽酸硫胺、1g·L^-1葡萄糖、0~0.001g·L^-1丁二酸、0~0.001g·L^-1丁二酸鈉、0.011g·L^-1芬紅、0~0.0001?g·L^-1卡那霉素以及0.1~0.3g·L^-1必需氨基酸；

⑼線粒體：線粒體提取液配方為0.22mol·L^-1甘露醇，0.07mol·L^-1蔗糖，0.02mol·L^-1羥乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES，0.002mol·L^-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl，0.001?mol·L^-1乙二胺四乙酸二鈉鹽EDTA.2Na，pH?為7.0~7.4；線粒體測試液配方為0.22?mol·L^-1甘露醇，0.07mol·L^-1蔗糖，0.01mol·L^-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl，0.001mol·L^?-1乙二胺四乙酸二鈉鹽EDTA.2Na，pH為7.0~7.4；

2）卷煙煙氣凝聚物收集預處理：按標準吸煙機操作方法；將煙氣捕集后以水、質量分數為5~50%乙醇溶液或者質量分數為10~30%N,N-二甲基甲酰胺溶液為萃取液，進行振蕩或超聲波萃取，過濾后待用；

3）將步驟1）中的10~500ul的模式研究對象菌液加入1~5ml對應的液體培養基中；

4）將步驟2）的濃溶液或懸濁液分成0μl、5μl、10μl、20μl、50μl、100μl、200μl濃度梯度，并將不同濃度梯度的濃溶液或懸濁液加入步驟3）中液體培養基中，振蕩均勻后，

5）將步驟4）中振蕩均勻的液體培養基置于量熱儀LKB?2277或TAM?air或TAM?3中，設定溫度為20~40℃恒溫，

6）待溫度達到設定值且穩定后，將培養液導入微量熱儀的檢測室，開始采集數據；

7）根據采集數據進行作圖、擬合和計算，獲得相關的生長產熱曲線及熱動力學參數，其參數包括代謝過程的生長速率常數k、最大產熱功率P_m、總放熱量Q、傳代時間t_G、最大熱功率對應的時間t_m、出峰時間t_p和抑制率I、半抑制濃度IC₅₀；

8）比較相關的生長產熱曲線及熱動力學參數相關的生長產熱曲線及熱動力學參數，分析加入不同煙氣收集液對模式研究對象正常代謝的影響及其差異，獲得有關卷煙煙氣安全性的初步評估；分析有卷煙改良前后的熱動力學參數的變化，獲得新型卷煙是否具有減害的效果。

2.根據權利要求1所述的卷煙香精香料安全性篩選的生物熱化學方法，其特征在于：所述成纖維細胞的培養基配方中的非必需氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸和胱氨酸中任意幾種；MEM培養基中必需氨基酸為賴氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和組氨酸中的任意幾種。