[發明專利]一種大菱鲆C型溶菌酶及其構建和應用

無效

• 申請號: 201210452265.6
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN102952788A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 孫黎;于蘭萍
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;C12N15/56;C12N15/70;A61K38/47;A61P31/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及分子微生物學領域，具體的說是一種大菱鲆C型溶菌酶及其構建和應用。

背景技術

溶菌酶（lysozyme），又稱為胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，它能降解細菌細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，從而破壞細胞壁，使得胞內容物釋放，由此導致細菌死亡。根據其序列結構特點，溶菌酶可分為六大類，其中C型溶菌酶(C-type?lysozyme)在動物中是一種主要類群，廣泛存在哺乳動物、鳥類、魚類等。溶菌酶是一種重要的天然免疫因子，在抗病原感染過程中發揮重要作用，因此在臨床上，溶菌酶用于抗細菌和病毒感染以及消腫止痛等。另外，溶菌酶在食品工業中被用作防腐劑。

發明內容

本發明目的在于提供一種大菱鲆C型溶菌酶及其構建和應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種大菱鲆C型溶菌酶，溶菌酶為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。

大菱鲆C型溶菌酶的制備方法，

1）菌株BL21/pSmLysC的構建：

以大菱鲆cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增，PCR產物純化后與載體pEASY-E2于室溫連接2－8小時，連接混合液轉化大腸桿菌BL21(DE3),篩選轉化子，即為BL21/pSmLysC；所述F1為5’-GATATCATGAAAGTCTTCGAACGCTGT-3’，R1為5’-GATATCCACACCACATCCTGCCAC-3’；

2）溶菌酶的表達和制備

將上述步驟1）的BL21/pSmLysC在含有安卡青霉素的LB培養基上培養至OD₆₀₀為0.5,加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其終濃度達到1mM，28℃繼續搖動培養5－6小時，而后用親和層析柱純化重組蛋白，即為SEQ?IDNo.1中氨基酸序列所示。

大菱鲆C型溶菌酶的應用，所述溶菌酶可作為革蘭氏陽性菌的抑菌劑。所述革蘭氏陽性菌為藤黃微球菌（Micrococcus?luteus）、海豚鏈球菌（Strep?tococcus?iniae）或金黃色葡萄球菌（Staphyl?ococcus?aureus）。

本發明具有如下優點：本發明的溶菌酶可以有效裂解多種革蘭氏陽性菌，因而可以用于防控革蘭氏陽性菌相關疾病。

附圖說明

圖1為本發明實施例純化得到的溶菌酶電泳圖譜（其中，純化得到的溶菌酶為泳道2；泳道1：分子量marker。）。

圖2為本發明實施例溶菌酶的殺菌效應例圖（其中，圖A為本發明實施例制備的溶菌酶產生的抑菌圈；圖B為PBS陰性對照）。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。

在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法：

1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。

2.大腸桿菌用Hanahan方法（Sambrook?and?Russell:Molecular?Cloning:A?Laboratory?Mannual.Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press?2001）；酵母轉化按Invitrogen公司的方法（Catalog?no.V175-20）；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）按照Sambrook?and?Russell:Molecular?Cloning:A?Laboratory?Mannual.Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press2001。

3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術有限公司”，北京。

實施例1

本發明的溶菌酶為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列。

序列表SEQ?ID?No.1為：

MRCLLLLLLVPVPGAKVFERCEWARLLKRNGMSNYRGISLADWVCLSQWESSYNTRATNRNTDGSTDYGIFQINSRWWCDNGQTPTSNACGISCSALLTDDVGAAIICAKHVVRDPNGIGAWVAWKRHCQGQDLSSYVAGCGV

（a）序列特征：

●長度：143

●類型：氨基酸序列