[發(fā)明專利]用于神經(jīng)干細胞培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)載體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210452188.4
• 申請日: 2012-11-13
• 公開（公告）號: CN103087914A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 安沂華;李海龍;董健伸;羅美華
• 申請（專利權(quán)）人: 安沂華
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12N5/0797;C12N5/0793;C12N5/079
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種-NH₂化學(xué)基團修飾的細胞培養(yǎng)載體及其制備方法，以及所述的細胞培養(yǎng)載體在培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中的應(yīng)用，特別是所述細胞培養(yǎng)載體在促進培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞的粘附、遷移和分化中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

神經(jīng)干細胞(Neural?Stem?Cells，NSCs)作為種子細胞聯(lián)合組織技術(shù)是治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性疾病最有前途的方法之一。眾所周知，細胞的粘附、遷移和分化能力與其所處的周圍微環(huán)境尤其是所用生物材料表面物理化學(xué)特性有著密切的關(guān)系。已有報道表明生物材料表面特性影響微環(huán)境中的蛋白的吸附可引發(fā)不同的細胞應(yīng)答，因此，一些具有生物活性的片段如肽鏈、多聚氨基酸甚至活性化學(xué)官能基團被引入生物材料，并試圖通過控制細胞與材料表面間的相互作用而達到控制細胞行為的目的，而這些片段之所以具有生物活性功能，是由于其功能基團如羧基、羥基、氨基(-NH₂)與微環(huán)境中利于細胞生長的粘附分子結(jié)合而發(fā)揮作用。?

已有報道表明，貼壁粘附是NSCs分化的前提之一，而不同化學(xué)功能基團對NSCs的行為具有不同的影響，相對于其他化學(xué)活性基團，-NH₂能夠明顯促進NSCs在經(jīng)化學(xué)修飾后在蓋玻片上粘附和遷移，并似乎能提高神經(jīng)元的分化比例，原因可能是由于細胞表面帶負電荷，因此，具有正電荷特性和最大活性的官能基團-NH₂，可能最適合細胞粘附。?

由于細胞之間信息傳遞對細胞發(fā)育和細胞生物學(xué)行為起著非常重要的作用，改變材料和局部接種細胞的密度可能會影響神經(jīng)干細胞粘附、遷移、增值和分化。而在以往的報道中，在研究材料表面化學(xué)基團與細胞之間的相互作用時，使用的是含血清培養(yǎng)基或是包含粘附蛋白的培養(yǎng)基，因此，很難區(qū)分是化學(xué)基團還是粘附因子的作用改變了細胞行為。?

發(fā)明內(nèi)容

在本發(fā)明中，我們將NSCs種植在經(jīng)化學(xué)修飾后具有不同密度的-NH₂蓋玻片上，觀察不同密度的-NH₂基團在無血清培養(yǎng)條件下對NSCs粘附、遷移、增殖和分化等生物學(xué)行為的影響，從而確定-NH₂作為一種適合細胞貼壁的化學(xué)修飾基團，對神經(jīng)干細胞在材料表面的附著密度，及生物學(xué)行為的調(diào)控作用。?

更具體而言，本發(fā)明涉及一種-NH₂化學(xué)基團修飾的細胞培養(yǎng)載體及其制備方法，以及所?述的細胞培養(yǎng)載體在培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中的應(yīng)用，特別是所述細胞培養(yǎng)載體在促進培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞的粘附、遷移和分化中的應(yīng)用。?

本發(fā)明所述的-NH₂化學(xué)基團修飾的細胞培養(yǎng)載體的制備方法如下：?

步驟一，?

將蓋玻片(石英蓋玻片，大小22*22mm)浸泡在1％十二烷基硫酸鈉(Sigma，USA)溶液中30分鐘，隨后再將其浸泡在0.1M鹽酸溶液中30分鐘，然后用雙蒸水洗3遍，吹干，備用；?

步驟二，?

將經(jīng)上述步驟一處理后的得到的潔凈蓋玻片浸泡在＞70％的濃硫酸溶液和30％雙氧水溶液中使之羥基化10分鐘，再浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(Sigma，USA)中化學(xué)連接-NH₂，去離子水清洗三遍，75％酒精隔夜清洗消毒，氮氣吹干，即獲得所述的NSCs細胞培養(yǎng)載體。?

所述的浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷中化學(xué)連接-NH₂的步驟為，連接反應(yīng)時間為2～14小時，優(yōu)選為12小時；反應(yīng)溫度為4～40℃，優(yōu)選為25℃；反應(yīng)底物3-氨基丙基三乙氧基硅烷的濃度為05～20％，優(yōu)選為20％。?

本發(fā)明所述的細胞培養(yǎng)載體在培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中的應(yīng)用方法如下，?

培養(yǎng)NSCs前，將所述載體放入培養(yǎng)板(Corning，USA)內(nèi)，75％酒精隔夜消毒后用無菌緩沖磷酸鹽溶液(PBS緩沖液，pH7.2-7.4)徹底清洗后備用。?

將細胞系形式增殖的神經(jīng)干細胞(天壇神經(jīng)外科研究所，干細胞室提供)在預(yù)冷的Hank’s平衡鹽液(pH7.2)中吹打成單細胞懸液，在無血清培養(yǎng)基(DMEN/F12，HyClone)條件下接種于上述放入所述載體的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。?

需要指出的是，上述細胞系僅為例舉所用，本發(fā)明所述的載體材料并不僅限于培養(yǎng)所述神經(jīng)干細胞，申請入的相關(guān)工作表明，本發(fā)明所述的載體材料在培養(yǎng)例如CHB、HUES系列的干細胞(NIH干細胞庫來源的干細胞株，可參見http://stemcells.nih.gov)時也獲得了比較好的結(jié)果。?