[發明專利]利用家蠶生物反應器表達輪狀病毒VP6蛋白的方法

無效

• 申請號: 201210451970.4
• 申請日: 2012-11-12
• 公開（公告）號: CN102978240A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 李司;張耀洲
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.重組病毒BmNPV-RVVP6的獲得方法，其特征是包括以下步驟：

1）、選用A組輪狀病毒VP6?基因，該基因編碼的序列為SEQ?ID?NO:1所示；

2）、構建重組轉移載體質粒pBacPAK₈-RVVP6；

3）、將構建所得的重組轉移載體質粒pBacPAK₈-RVVP6與已線性化的病毒Bm-BacPAK6?DNA經脂質體介導共轉染家蠶細胞，獲得重組病毒BmNPV-RVVP6。

2.根據權利要求1所述的重組病毒BmNPV-RVVP6的獲得方法，其特征是：所述步驟2）為：

VP6基因的PCR擴增產物經純化后，得純化后PCR產物，用限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，隨后插入經過同樣酶切的轉移質粒pBacPAK₈中，并轉化到大腸桿菌TG1感受態細胞進行陽性菌落篩選，得質粒pBacPAK₈-RVVP6。

3.根據權利要求2所述的重組病毒BmNPV-RVVP6的獲得方法，其特征是：所述步驟2）包括以下步驟：

①、純化后載體質粒pBacPAK₈和純化PCR產物的雙酶切；

②、酶切產物處理：

雙酶切后，凝膠電泳，分別割膠回收PCR酶切后小片段以及pBacPAK₈載體大片段；利用膠回收試劑盒分別純化回收；

③、重組連接載體DNA和目的基因；

連接反應體系：

連接反應條件：4?℃連接12~14h；

④、大腸桿菌感受態細胞的制備與重組DNA分子的轉化；

⑤、挑斑及提取重組質粒：

挑斑：

用無菌槍頭從轉化平板上挑取生長狀態良好的白色單菌落，分別接種于含Amp?50?μg/mL的LB液體培養基中，37?℃，250?rpm振蕩培養8~10?h；

提取重組質粒：

a.取1.5?mL培養液倒入Eppendorf管中，4?℃，12000?rpm離心30?sec；

b.棄盡上清，菌體沉淀重懸于預冷的100?μL溶液Ⅰ中，渦旋振蕩混勻；

c.冰浴10?min加入溶液Ⅱ200?μL，顛倒Eppendorf管5次，冰浴5?min，使溶液變澄清；

d.加入150?μL預冷的溶液Ⅲ，并倒置離心管，振蕩30?sec，冰浴5?min，4℃，12000?rpm離心10?min；

溶液Ⅰ為：

50?mmol/L????????葡萄糖

25?mmol/L????????Tris-HCl?(pH?8.0)

10?mmol/L????????EDTA?(pH?8.0)；

其余為去離子水；

溶液Ⅱ為：

0.2?mol?NaOH、1%（質量濃度）SDS；其余為去離子水；

溶液Ⅲ由5?mol/L?NaAc??60?mL、冰醋酸11.5?mL和去離子水?28.5?mL組成；

e.吸出上清液轉入干凈Eppendorf管中，加入等體積的由酚、氯仿和異戊醇組成的混合液，顛倒混勻，4℃，12000?rpm離心5?min；所述混合液中酚、氯仿和異戊醇的體積比為25：24：1；

f.將上清液移入Eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3?mol/L?NaAc（pH5.2），顛倒混勻后室溫放置5?min；

g.4?℃，12000?rpm離心10?min；

h.棄上清，加入1?mL預冷的70%（體積濃度）乙醇洗沉淀一次，真空干燥5?min或室溫干燥；

i.所得質粒為重組質粒pBacPAK₈-RVVP6。

4.根據權利要求1、2或3所述的重組病毒BmNPV-RVVP6的獲得方法，其特征是所述步驟3）為：

提取家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK_6?DNA，并用Bsu36?I酶切使之線性化，得線性化家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK_6?DNA；提取pBacPAK₈-RVVP6質粒與線性化家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK_6?DNA共轉染入家蠶BmN細胞。

5.利用家蠶生物反應器表達輪狀病毒VP6蛋白的方法，其特征是包括以下步驟：

將重組病毒BmNPV-RVVP6?接種于家蠶細胞，從而進行重組蛋白RVVP6在家蠶細胞中的表達鑒定。