[發(fā)明專利]一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗的滅活檢驗(yàn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210449979.1
• 申請(qǐng)日: 2012-11-12
• 公開（公告）號(hào): CN103122392A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳晟生;鄭藝明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/02;C12R1/93
• 代理公司: 福州君誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸用醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗的滅活檢驗(yàn)方法。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒（porcine?circovirus，PCV）在分類學(xué)上屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為已知的最小的動(dòng)物病毒之一。病毒粒子直徑14-17nm，呈20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無囊膜，含有共價(jià)閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA，基因組大小約為1.76kb。PCV對(duì)外界理化因子的抵抗力相當(dāng)強(qiáng)，即便在PH3的酸性環(huán)境及72℃的高溫環(huán)境中也能存活一段時(shí)間，氯仿作用不失活，無血凝活性。現(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性的病毒。PCV2為致病性的病毒。?

PCV-2是斷乳仔豬多系統(tǒng)綜合征(?Post-weaning?multi-systemic?wasting?syndrome?，PMWS)?的主要病原，具有較強(qiáng)的易感性，感染豬可自鼻液、糞便等廢物中排出病毒，經(jīng)口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬。自1991?年P(guān)MWS?在北美最先發(fā)現(xiàn)以來，已在世界范圍內(nèi)流行。由于PCV-2?經(jīng)常與多種病原混合感染，典型性臨床癥狀有消瘦、皮膚蒼白、腹瀉、呼吸障礙及輕度的黃疸，還包括神經(jīng)癥狀、繁殖障礙、皮炎等。PCV-2?及其相關(guān)的豬病死亡率10?%~30?%不等，較嚴(yán)重的豬場(chǎng)在暴發(fā)本病時(shí)死淘率高達(dá)40?%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)中的滅活，是指破壞微生物的生物學(xué)活性、繁殖能力和致病性，但盡可能不影響其免疫原性，被滅活的微生物主要用于生產(chǎn)滅活疫苗；或指破壞診斷血清或待檢血清中的補(bǔ)體活性，以避免補(bǔ)體對(duì)診斷試驗(yàn)的干擾作用。

滅活劑具有特異性，某些滅活劑只對(duì)一部分微生物有明顯的滅活作用，不同的滅活劑對(duì)同一種微生物的滅活效果也不同，如酚類能抑制和殺滅大部分細(xì)菌的繁殖體，5%的石炭酸溶液于數(shù)小時(shí)內(nèi)能殺死細(xì)菌的芽孢。真菌和病毒對(duì)酚類不太敏感。

甲醛溶液為常用的滅活劑，滅活機(jī)理為甲醛的醛基作用于微生物蛋白質(zhì)的氨基產(chǎn)生羥甲基胺，作用于羧基形成甲基二醇單酯,?作用于羥基生成羥基甲酚，作用于巰基形成亞甲基二醇。上述反應(yīng)生成的羥甲基等代替敏感的氫原子，破壞生命的基本結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微生物死亡。?

現(xiàn)有的其他滅活疫苗的滅活檢驗(yàn)方法，未根據(jù)豬圓環(huán)病毒的生長特點(diǎn)和滅活劑的特性而設(shè)計(jì)，不適合于豬圓環(huán)病毒滅活苗的滅活檢驗(yàn)操作。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于根據(jù)豬圓環(huán)病毒的生長特點(diǎn)和滅活劑的特性而設(shè)計(jì)的一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗的滅活檢驗(yàn)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗的滅活檢驗(yàn)方法，所述的檢驗(yàn)方法包括以下步驟：

1)?用細(xì)胞瓶培養(yǎng)PK-15細(xì)胞18-24h，生長密度達(dá)50-80%時(shí)，棄去營養(yǎng)生長液，將滅活后的豬圓環(huán)病毒液做10倍稀釋后，取1-2mL接種于細(xì)胞瓶中，將細(xì)胞瓶置37℃的CO₂培養(yǎng)箱中，使滅活后的豬圓環(huán)病毒液在PK-15細(xì)胞上吸附40min，期間振搖1-2次；

2)?吸附后，在細(xì)胞瓶中加入營養(yǎng)維持液，將細(xì)胞瓶置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3天后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，并凍融3次；

3)?取凍融后的細(xì)胞培養(yǎng)液1-2mL，同樣接種于傳代并已生長18-24h，生長密度達(dá)50-80%的PK-15細(xì)胞上吸附40min后，在細(xì)胞瓶中加入營養(yǎng)維持液，將細(xì)胞瓶置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3天后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，凍融3次；依此法連續(xù)盲傳3代，取第1代、第2代和第3代或只取第3代的細(xì)胞培養(yǎng)液接種于接近單層的細(xì)胞板上繼續(xù)培養(yǎng)2-3天后，做熒光抗體染色，以PK-15健康細(xì)胞作陰性對(duì)照，在熒光顯微鏡下觀察判定，以不出現(xiàn)特異性的綠色熒光為合格樣品，出現(xiàn)特異性的綠色熒光為不合格樣品。

進(jìn)一步，所述的營養(yǎng)生長液、營養(yǎng)維持液在細(xì)胞瓶中加入量為細(xì)胞瓶容量的1/10；營養(yǎng)生長液、營養(yǎng)維持液為MEM粉劑細(xì)胞培養(yǎng)基用超純水配成液體，經(jīng)消毒、滅菌后，加入犢牛或胎牛血清，調(diào)節(jié)pH值為7.4-7.8而成，用于維持細(xì)胞、病毒的生長、繁殖。

進(jìn)一步，所述的加入的犢牛或胎牛血清，營養(yǎng)生長液中含有犢牛或胎牛血清量為8-10%；營養(yǎng)維持液中含有犢牛或胎牛血清量為2-4%。

進(jìn)一步，所述的營養(yǎng)生長液和營養(yǎng)維持液中還含有0.5-1%的抗生素，所述的抗生素為青霉素、鏈霉素或慶大霉素。

豬圓環(huán)病毒具有適于在有絲分裂過程中的細(xì)胞上復(fù)制的生長特點(diǎn)和在細(xì)胞內(nèi)繁殖高峰病毒含量最高時(shí)最易檢出的特點(diǎn)。