[發(fā)明專利]透射光學顯微鏡的樣品梯度照明方法和裝置

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210448976.6
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN102955239A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發(fā)明（設計）人: 蔣禮陽;陳成剛
• 申請（專利權）人: 蔣禮陽;陳成剛;南京東利來光電實業(yè)有限責任公司
• 主分類號: G02B21/08
• 分類號: G02B21/08;G02B7/00;G02B27/09
• 代理公司: 江蘇愛信律師事務所 32241
• 代理人: 劉琦;許峰

技術領域

本發(fā)明屬于顯微成像領域，涉及一種增強顯微鏡成像對比度的成像方法。

背景技術

傳統(tǒng)上來說，為了觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞，增加顯微鏡成像對比度方面，目前有3種方法，分別是：

1．相差顯微鏡（Phase?Contrast?Microscopy），由荷蘭科學家、諾貝爾獎獲得者澤爾尼克于1935年發(fā)明。主要是利用物體不同結構成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉變?yōu)檎穹睿詈笸ㄟ^帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實現(xiàn)觀測。雖然可以增加成像對比度，但是需要樣品厚度很薄，所以并不適合多數(shù)的生物應用；

2．微分干涉顯微鏡（Differential?Interference?Contrast?Microscopy），由波蘭物理學家諾瑪斯基于1952年在相差顯微鏡的基礎上發(fā)明，與前者相比，其可以使用更厚的樣品，而且成像的立體感更好，故目前得到了廣泛應用；

3．傾斜式照明（Oblique?illumination），為一種增加成像對比度的最簡單方法。通常采用在聚光鏡中加一個大小可調(diào)的狹縫，當光線在側面入射時，可以將樣品厚度和密度的不同，用光線的強弱來對比出來。雖然可以通過旋轉狹縫來增加對比度，但卻明顯的降低了分辨率。

以上三種方法，用的最多的便是微分干涉顯微鏡，尤其在廣泛使用的動物腦組織切片的電生理記錄中。為了增加照明光線對腦組織的穿透性，提高成像深度，現(xiàn)在多采用了對生物組織穿透性更強的紅外光來激發(fā)，但其缺點是：1.使用多個偏振器件，光路復雜，而且造價高；2.對比度不夠高，而起光強度低；3.使用了偏振棱鏡，使其無法和應用廣泛的雙光子顯微鏡光路相兼容。現(xiàn)有的微分干涉顯微鏡，必須在整個光路上放置起偏器，諾瑪斯基棱鏡與檢偏器，造成使用上的不方便，尤其是其無法和雙光子顯微鏡配套觀察。

發(fā)明內(nèi)容

技術問題：本發(fā)明提供了一種可方便用戶利用透射光尋找樣品、可即插即用的透射光學顯微鏡的樣品梯度照明方法，以及實現(xiàn)該方法的透射光學顯微鏡的樣品梯度照明裝置。???????

技術方案：本發(fā)明的透射光學顯微鏡的樣品梯度照明方法，包括以下步驟：

1）在反射鏡與紅外光源之間的入射光路上放置焦距均為f的第一凸透鏡和第二凸透鏡，第一凸透鏡和第二凸透鏡的焦點位于兩個凸透鏡之間，反射鏡設置在光學顯微鏡上聚光鏡的入射光路一側，用以將入射光反射進聚光鏡，第一凸透鏡位于臨近紅外光源一側，第二凸透鏡位于臨近反射鏡一側，第一凸透鏡與第二凸透鏡的間距在f至2f之間；

2）調(diào)節(jié)紅外光源與第一凸透鏡的間距，直至紅外光源通過第一凸透鏡形成的共軛平面位于第二凸透鏡的焦點處時，固定紅外光源和第一凸透鏡，在紅外光源的共軛平面處放置空間濾波器，在空間濾波器與第一凸透鏡焦點之間的光路上放置散射片，空間濾波器包括遮光部分和透光部分，透光部分位于空間濾波器的邊緣；

3）保持紅外光源、第一凸透鏡、第二凸透鏡、空間濾波器和散射片之間的位置關系，調(diào)節(jié)第二凸透鏡與反射鏡的間距，直至空間濾波器通過第二凸透鏡和反射鏡形成的共軛平面位于聚光鏡的孔徑平面上時，固定第二凸透鏡；

4）再次調(diào)節(jié)紅外光源與第一凸透鏡的間距，直至紅外光源通過第一凸透鏡形成的共軛平面再次位于第二凸透鏡的焦點處時，固定紅外光源和第一凸透鏡；

5）開啟紅外光源，圍繞光路軸線旋轉調(diào)節(jié)空間濾波器，觀察不同位置樣品的三維形態(tài)，沿光路軸線水平移動散射片，調(diào)節(jié)空間濾波器和散射片的間距，觀察樣品在不同距離下的對比度增強效果。????

本發(fā)明的實現(xiàn)上述方法的透射光學顯微鏡的樣品梯度照明裝置，包括殼體，以及設置于殼體內(nèi)的、均位于同一軸線上的第一凸透鏡、第二凸透鏡、空間濾波器和散射片，第一凸透鏡和第二凸透鏡的焦點位于兩個凸透鏡之間且焦距均為f，空間濾波器包括遮光部分和透光部分，透光部分位于空間濾波器的邊緣，空間濾波器位于第二凸透鏡的焦點處，散射片位于空間濾波器和第一凸透鏡焦點之間，空間濾波器能夠圍繞光路軸線旋轉調(diào)節(jié)，散射片能夠沿光路軸線水平移動調(diào)節(jié)。

本發(fā)明的透射光學顯微鏡的樣品梯度照明裝置中，空間濾波器連接有旋轉調(diào)節(jié)裝置，用以圍繞光路軸線旋轉調(diào)節(jié)空間濾波器，散射片連接有軸向調(diào)節(jié)裝置，用以沿光路軸線水平移動調(diào)節(jié)散射片。

本發(fā)明的透射光學顯微鏡的樣品梯度照明裝置中，第一凸透鏡和第二凸透鏡的間距可以是能夠調(diào)節(jié)的。

本發(fā)明通過光學元件的組合，將光通過樣品后的不可見相位變化，轉換成可見的光強度梯度變化。