[發明專利]運用核酸恒溫擴增技術檢測肺炎克雷伯菌的試劑及其擴增方法

無效

• 申請號: 201210448968.1
• 申請日: 2012-11-12
• 公開（公告）號: CN102899419A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 張霞;鄭文杰;劉偉;張宏偉;曲鵬;吳冬雪;趙良娟;劉培;高旗利
• 申請（專利權）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及病原體檢驗技術，具體地說是運用核酸恒溫擴增反應來檢測肺炎克雷伯菌的技術。

背景技術

肺炎克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，病變中滲出液粘稠而重，致使葉間隙下墜。細菌具有莢膜，在肺泡內生長繁殖時，引起組織壞死、液化、形成單個或多發性膿腫。病變累及胸膜、心包時，可引起滲出性或膿性積液。病灶纖維組織增生活躍，易于機化；纖維素性胸腔積液可早期出現粘連。在院內感染的敗血癥中，肺炎克雷伯菌為重要病原菌，病死率較高。

肺炎克雷伯菌(KNP)是臨床分離及醫院感染的重要致病菌之一，隨著β-內酰胺類及氨基糖苷類等廣譜抗菌素的廣泛使用，細菌易產生超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC酶)以及氨基糖苷類修飾酶(AMEs)，對常用藥物包括第三代頭孢菌素和氨基糖苷類呈現出嚴重的多重耐藥性。肺炎克雷伯菌引起的醫院感染率近期逐年增高，且多耐藥性菌株的不斷增加常導致臨床抗菌藥物治療的失敗和病程遷延。肺炎克雷伯菌耐藥機制主要包括產生β-內酰胺酶、生物被膜的形成、外膜孔蛋白的缺失。抗菌藥物主動外排等，抗菌藥物耐藥基因水平播散是多藥耐藥菌株臨床加劇的重要原因。

因此能夠快速有效的檢測肺炎克雷伯菌對于與之相關的疾病防控具有重要的意義。

肺炎克雷伯菌的檢測方法有常規培養和生理生化反應檢測等多種方法，與傳統檢測手段相比，本發明很好的解決了目前大多數檢測技術手段的弊端。首先，無需任何復雜的儀器，只需要一臺簡單的加熱器，如普通的水浴鍋或以電、電池為能源的加熱器，使得核酸診斷可以前所未有地用于現場診斷。其次，可以加快反應速度，縮短反應時間。第三，易于操作者掌握，對反應條件的要求相對寬松，使得以該技術為基礎的產品對操作人員的技能要求不高，這也為核酸試劑的普及創造了條件。

發明內容

針對肺炎克雷伯菌，本發明克服了現有技術中的缺點，提供一種運用等溫擴增技術快速、便捷、低成本的試劑和檢測方法。

本發明提供了更加快速和低成本通過等溫擴增方法檢測肺炎克雷伯菌的方法。本發明是通過以下技術方案實現的：

(1)設計特異性寡核苷酸引物用于等溫擴增技術檢測；

(2)整合各引物使之不相互干擾。

(3)以引物序列組，擴增待測樣品模板，進行目的基因的特異性擴增；

(4)擴增完畢后可通過使用商業化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產物進行檢測，陽性結果呈現兩條紫紅色條帶，陰性結果呈現一條紫紅色條帶。

該方法包括：應用該方法檢測肺炎克雷伯菌所使用的引物組和與之配套的等溫擴增反應條件。其中引物序列如下：

該引物序列參照GenBank中的序列AP006725.1?Klebsiella?pneumoniaesubsp.pneumoniae?NTUH-K2044DNA，complete?genome中的溶質接合蛋白序列為基礎進行設計。

引物：

SEQ?ID?NO.1：5’-TACGCCCCGGTCTGAC

SEQ?ID?NO.2：5’-GCGCTTTCACCCCCAAC

SEQ?ID?NO.3：5’-GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATT

SEQ?ID?NO.4：5’-CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGG

SEQ?ID?NO.5：5’-TGGCAACGACTGGTCTCGCC

SEQ?ID?NO.6：5’-TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。

其中序列SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6使用特殊基團標記，擴增產物中包含上述基團，以便同核酸恒溫擴增檢測試紙條反應。

本發明中反應體系中各組分構成比例如下：

其中Bs?t酶緩沖液的成分為20mM?Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mM?KCl、2mM?MgSO4、質量百分比0.1％Triton?X-100、10mM?dNTP，且pH為8.8。

等溫擴增程序為：61℃60分鐘。

擴增完畢后可通過使用商業化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產物進行檢測，陽性結果呈現兩條紫紅色條帶(分別為檢測線和質控線)，陰性結果呈現一條紫紅色條帶(質控線)。