[發(fā)明專利]于細(xì)胞內(nèi)制造融合蛋白質(zhì)的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210448470.5 | 申請日: | 2012-11-09 |
| 公開(公告)號: | CN103045627A | 公開(公告)日: | 2013-04-17 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人: | 趙云鵬;姜中人;林莉鈞;王祉雯;陳柏庭 | 申請(專利權(quán))人: | 逢甲大學(xué) |
| 主分類號: | C12N15/62 | 分類號: | C12N15/62;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/63;C07K19/00 |
| 代理公司: | 上海申新律師事務(wù)所 31272 | 代理人: | 竺路玲 |
| 地址: | 中國臺灣臺*** | 國省代碼: | 中國臺灣;71 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 細(xì)胞內(nèi) 制造 融合 蛋白質(zhì) 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明關(guān)于一種融合蛋白質(zhì)的制造方法,且特別是攸關(guān)一種于細(xì)胞內(nèi)制造融合蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)
融合蛋白質(zhì)(Fusion?protein),是指一種連接有至少二個以上多勝肽的蛋白質(zhì),可能保有單一多勝肽原有的生物功能,或是呈現(xiàn)不同于單一多勝肽的生物功能。
舉例來說,融合有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)及半乳糖去氫酶(galactose?dehydrogenase)的蛋白質(zhì),經(jīng)細(xì)胞外實驗后,證實其相較于單一酵素具有酵素動力學(xué)上的優(yōu)勢(請參閱Ljungcrantz.?P.,?et?al.,?Biochem.,?1989,?28:?8786-8792)。又舉例來說,融合有海藻糖磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate?synthetase)及海藻糖磷酸脂酶(trehalose-6-phosphate?phosphatase)的蛋白質(zhì),經(jīng)細(xì)胞外實驗后,證明其不僅保留單一酵素本身的活性外,更較單一酵素具有酵素動力學(xué)上的優(yōu)勢(請參閱Seo?H.?S.,?et?al.,?Appl.?Environ.?Microbiol.,?2000,?66:?2484-2490)。再舉例來說,甜菜醛去氫酶(betaine?aldehyde?dehydrogenase)-膽堿去氫酶(chloline?dehydrogenase)融合蛋白質(zhì)于大腸桿菌(Escherichia?coli)或煙草(Nicotiana?tabacum)內(nèi)表現(xiàn)時,可以提升這些生物體抵抗逆境的能力(請參閱Yilmaz?J.?L.,?et?al.,?Biotechnol.?Progs.,?2002,?18:?1176-1182)。
融合蛋白質(zhì)可以自然存在于細(xì)胞體內(nèi),例如癌癥細(xì)胞中的bcr-abl融合蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)也可以有目的地透過人為方式存在于細(xì)胞體內(nèi),基因工程已提供一般實驗流程來實現(xiàn)之,如聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerase?chain?reaction,PCR)、限制酶剪切(enzyme?digestion)、核酸接合(DNA?ligation)、…等等。詳細(xì)地說,須將二個以上各自編碼一個多勝肽的基因片段連接在一起,再送入至細(xì)胞體內(nèi)。接著,于細(xì)胞體內(nèi)表現(xiàn)這些多勝肽而形成融合蛋白質(zhì)。
就基因工程而言,制備融合蛋白質(zhì)的方法雖然相當(dāng)簡單,但是融合蛋白質(zhì)大多屬于大分子,使得其在空間上的彈性度及自由度受到阻礙,且彼此易相互干擾而無法折迭,造成融合蛋白質(zhì)失去生物活性,甚至于細(xì)胞體內(nèi)形成不可溶的包涵體(inclusion?body)。因此,后續(xù)須破壞細(xì)胞體取得包涵體,再從包涵體得到失活的融合蛋白質(zhì),并于適當(dāng)溶液中使失活的融合蛋白質(zhì)折迭而復(fù)性。但復(fù)性過程畢竟系屬人為操作的,仍不比細(xì)胞體內(nèi)提供的環(huán)境,因此在溶液中折迭的融合蛋白質(zhì)的生物功能仍然有改善空間。
發(fā)明內(nèi)容
自然界中,厭氧微生物演化出一種相當(dāng)特殊且可以有效分解纖維素的胞器。厭氧微生物在細(xì)胞外形成纖維體(cellulosome),纖維體含有一撐架蛋白質(zhì)(scaffolding?protein),而撐架蛋白質(zhì)具有一黏附區(qū)域(coherin?domain),黏附區(qū)域結(jié)合至一纖維素水解酶(cellulase)的錨定區(qū)域(dockerin?domain),藉此容許纖維體成為一酵素復(fù)合體(enzyme?complex)而有效地分解纖維素(請參閱Doi?R.?H.,?et?al.,?Nature?Rev.?Microbiol.,?2004,?2:?541-551)。
本發(fā)明乃是根據(jù)黏附區(qū)域結(jié)合至錨定區(qū)域的特性,而發(fā)現(xiàn)二各具有黏附區(qū)域及錨定區(qū)域的融合蛋白質(zhì)在同一宿主細(xì)胞中被表現(xiàn),黏附區(qū)域及錨定區(qū)域不易影響此二融合蛋白質(zhì)中其它多勝肽的彈性度及自由度,使得此些融合蛋白質(zhì)可以于宿主細(xì)胞內(nèi)折迭并相互融合,并提供此二融合蛋白質(zhì)優(yōu)異的生物功能。
因此,在第一方面,本發(fā)明揭露一種融合蛋白質(zhì)的制造方法,其包括下列步驟:(a)構(gòu)筑一編碼一錨定區(qū)域及一第一目標(biāo)勝肽的第一核酸分子;(b)構(gòu)筑一編碼一黏附區(qū)域及一第二目標(biāo)勝肽的第二核酸分子;(c)遞送第一核酸分子及第二核酸分子至一宿主細(xì)胞內(nèi);以及(d)培養(yǎng)宿主細(xì)胞,以表現(xiàn)一第一融合勝肽及一第二融合勝肽,且第一融合勝肽具有錨定區(qū)域及第一目標(biāo)勝肽,第二融合勝肽具有黏附區(qū)域及第二目標(biāo)勝肽,藉此錨定區(qū)域連接至黏附區(qū)域,以容許第一融合勝肽及第二融合勝肽相互融合。
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