[發(fā)明專利]于細(xì)胞內(nèi)制造融合蛋白質(zhì)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210448470.5
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN103045627A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙云鵬;姜中人;林莉鈞;王祉雯;陳柏庭
• 申請（專利權(quán)）人: 逢甲大學(xué)
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/63;C07K19/00
• 代理公司: 上海申新律師事務(wù)所 31272
• 代理人: 竺路玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明關(guān)于一種融合蛋白質(zhì)的制造方法，且特別是攸關(guān)一種于細(xì)胞內(nèi)制造融合蛋白質(zhì)的方法。

背景技術(shù)

融合蛋白質(zhì)（Fusion?protein），是指一種連接有至少二個以上多勝肽的蛋白質(zhì)，可能保有單一多勝肽原有的生物功能，或是呈現(xiàn)不同于單一多勝肽的生物功能。

舉例來說，融合有β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）及半乳糖去氫酶（galactose?dehydrogenase）的蛋白質(zhì)，經(jīng)細(xì)胞外實驗后，證實其相較于單一酵素具有酵素動力學(xué)上的優(yōu)勢（請參閱Ljungcrantz.?P.,?et?al.,?Biochem.,?1989,?28:?8786-8792）。又舉例來說，融合有海藻糖磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate?synthetase）及海藻糖磷酸脂酶（trehalose-6-phosphate?phosphatase）的蛋白質(zhì)，經(jīng)細(xì)胞外實驗后，證明其不僅保留單一酵素本身的活性外，更較單一酵素具有酵素動力學(xué)上的優(yōu)勢（請參閱Seo?H.?S.,?et?al.,?Appl.?Environ.?Microbiol.,?2000,?66:?2484-2490）。再舉例來說，甜菜醛去氫酶（betaine?aldehyde?dehydrogenase）-膽堿去氫酶（chloline?dehydrogenase）融合蛋白質(zhì)于大腸桿菌（Escherichia?coli）或煙草（Nicotiana?tabacum）內(nèi)表現(xiàn)時，可以提升這些生物體抵抗逆境的能力（請參閱Yilmaz?J.?L.,?et?al.,?Biotechnol.?Progs.,?2002,?18:?1176-1182）。

融合蛋白質(zhì)可以自然存在于細(xì)胞體內(nèi)，例如癌癥細(xì)胞中的bcr-abl融合蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)也可以有目的地透過人為方式存在于細(xì)胞體內(nèi)，基因工程已提供一般實驗流程來實現(xiàn)之，如聚合酶連鎖反應(yīng)（polymerase?chain?reaction，PCR）、限制酶剪切（enzyme?digestion）、核酸接合（DNA?ligation）、…等等。詳細(xì)地說，須將二個以上各自編碼一個多勝肽的基因片段連接在一起，再送入至細(xì)胞體內(nèi)。接著，于細(xì)胞體內(nèi)表現(xiàn)這些多勝肽而形成融合蛋白質(zhì)。

就基因工程而言，制備融合蛋白質(zhì)的方法雖然相當(dāng)簡單，但是融合蛋白質(zhì)大多屬于大分子，使得其在空間上的彈性度及自由度受到阻礙，且彼此易相互干擾而無法折迭，造成融合蛋白質(zhì)失去生物活性，甚至于細(xì)胞體內(nèi)形成不可溶的包涵體（inclusion?body）。因此，后續(xù)須破壞細(xì)胞體取得包涵體，再從包涵體得到失活的融合蛋白質(zhì)，并于適當(dāng)溶液中使失活的融合蛋白質(zhì)折迭而復(fù)性。但復(fù)性過程畢竟系屬人為操作的，仍不比細(xì)胞體內(nèi)提供的環(huán)境，因此在溶液中折迭的融合蛋白質(zhì)的生物功能仍然有改善空間。

發(fā)明內(nèi)容

自然界中，厭氧微生物演化出一種相當(dāng)特殊且可以有效分解纖維素的胞器。厭氧微生物在細(xì)胞外形成纖維體（cellulosome），纖維體含有一撐架蛋白質(zhì)（scaffolding?protein），而撐架蛋白質(zhì)具有一黏附區(qū)域（coherin?domain），黏附區(qū)域結(jié)合至一纖維素水解酶（cellulase）的錨定區(qū)域（dockerin?domain），藉此容許纖維體成為一酵素復(fù)合體（enzyme?complex）而有效地分解纖維素（請參閱Doi?R.?H.,?et?al.,?Nature?Rev.?Microbiol.,?2004,?2:?541-551）。

本發(fā)明乃是根據(jù)黏附區(qū)域結(jié)合至錨定區(qū)域的特性，而發(fā)現(xiàn)二各具有黏附區(qū)域及錨定區(qū)域的融合蛋白質(zhì)在同一宿主細(xì)胞中被表現(xiàn)，黏附區(qū)域及錨定區(qū)域不易影響此二融合蛋白質(zhì)中其它多勝肽的彈性度及自由度，使得此些融合蛋白質(zhì)可以于宿主細(xì)胞內(nèi)折迭并相互融合，并提供此二融合蛋白質(zhì)優(yōu)異的生物功能。

因此，在第一方面，本發(fā)明揭露一種融合蛋白質(zhì)的制造方法，其包括下列步驟：（a）構(gòu)筑一編碼一錨定區(qū)域及一第一目標(biāo)勝肽的第一核酸分子；（b）構(gòu)筑一編碼一黏附區(qū)域及一第二目標(biāo)勝肽的第二核酸分子；（c）遞送第一核酸分子及第二核酸分子至一宿主細(xì)胞內(nèi)；以及（d）培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以表現(xiàn)一第一融合勝肽及一第二融合勝肽，且第一融合勝肽具有錨定區(qū)域及第一目標(biāo)勝肽，第二融合勝肽具有黏附區(qū)域及第二目標(biāo)勝肽，藉此錨定區(qū)域連接至黏附區(qū)域，以容許第一融合勝肽及第二融合勝肽相互融合。