[發明專利]于細胞內制造融合蛋白質的方法

有效

• 申請號: 201210448470.5
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN103045627A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 趙云鵬;姜中人;林莉鈞;王祉雯;陳柏庭
• 申請（專利權）人: 逢甲大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/63;C07K19/00
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 竺路玲

技術領域

本發明關于一種融合蛋白質的制造方法，且特別是攸關一種于細胞內制造融合蛋白質的方法。

背景技術

融合蛋白質（Fusion?protein），是指一種連接有至少二個以上多勝肽的蛋白質，可能保有單一多勝肽原有的生物功能，或是呈現不同于單一多勝肽的生物功能。

舉例來說，融合有β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）及半乳糖去氫酶（galactose?dehydrogenase）的蛋白質，經細胞外實驗后，證實其相較于單一酵素具有酵素動力學上的優勢（請參閱Ljungcrantz.?P.,?et?al.,?Biochem.,?1989,?28:?8786-8792）。又舉例來說，融合有海藻糖磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate?synthetase）及海藻糖磷酸脂酶（trehalose-6-phosphate?phosphatase）的蛋白質，經細胞外實驗后，證明其不僅保留單一酵素本身的活性外，更較單一酵素具有酵素動力學上的優勢（請參閱Seo?H.?S.,?et?al.,?Appl.?Environ.?Microbiol.,?2000,?66:?2484-2490）。再舉例來說，甜菜醛去氫酶（betaine?aldehyde?dehydrogenase）-膽堿去氫酶（chloline?dehydrogenase）融合蛋白質于大腸桿菌（Escherichia?coli）或煙草（Nicotiana?tabacum）內表現時，可以提升這些生物體抵抗逆境的能力（請參閱Yilmaz?J.?L.,?et?al.,?Biotechnol.?Progs.,?2002,?18:?1176-1182）。

融合蛋白質可以自然存在于細胞體內，例如癌癥細胞中的bcr-abl融合蛋白質。融合蛋白質也可以有目的地透過人為方式存在于細胞體內，基因工程已提供一般實驗流程來實現之，如聚合酶連鎖反應（polymerase?chain?reaction，PCR）、限制酶剪切（enzyme?digestion）、核酸接合（DNA?ligation）、…等等。詳細地說，須將二個以上各自編碼一個多勝肽的基因片段連接在一起，再送入至細胞體內。接著，于細胞體內表現這些多勝肽而形成融合蛋白質。

就基因工程而言，制備融合蛋白質的方法雖然相當簡單，但是融合蛋白質大多屬于大分子，使得其在空間上的彈性度及自由度受到阻礙，且彼此易相互干擾而無法折迭，造成融合蛋白質失去生物活性，甚至于細胞體內形成不可溶的包涵體（inclusion?body）。因此，后續須破壞細胞體取得包涵體，再從包涵體得到失活的融合蛋白質，并于適當溶液中使失活的融合蛋白質折迭而復性。但復性過程畢竟系屬人為操作的，仍不比細胞體內提供的環境，因此在溶液中折迭的融合蛋白質的生物功能仍然有改善空間。

發明內容

自然界中，厭氧微生物演化出一種相當特殊且可以有效分解纖維素的胞器。厭氧微生物在細胞外形成纖維體（cellulosome），纖維體含有一撐架蛋白質（scaffolding?protein），而撐架蛋白質具有一黏附區域（coherin?domain），黏附區域結合至一纖維素水解酶（cellulase）的錨定區域（dockerin?domain），藉此容許纖維體成為一酵素復合體（enzyme?complex）而有效地分解纖維素（請參閱Doi?R.?H.,?et?al.,?Nature?Rev.?Microbiol.,?2004,?2:?541-551）。

本發明乃是根據黏附區域結合至錨定區域的特性，而發現二各具有黏附區域及錨定區域的融合蛋白質在同一宿主細胞中被表現，黏附區域及錨定區域不易影響此二融合蛋白質中其它多勝肽的彈性度及自由度，使得此些融合蛋白質可以于宿主細胞內折迭并相互融合，并提供此二融合蛋白質優異的生物功能。

因此，在第一方面，本發明揭露一種融合蛋白質的制造方法，其包括下列步驟：（a）構筑一編碼一錨定區域及一第一目標勝肽的第一核酸分子；（b）構筑一編碼一黏附區域及一第二目標勝肽的第二核酸分子；（c）遞送第一核酸分子及第二核酸分子至一宿主細胞內；以及（d）培養宿主細胞，以表現一第一融合勝肽及一第二融合勝肽，且第一融合勝肽具有錨定區域及第一目標勝肽，第二融合勝肽具有黏附區域及第二目標勝肽，藉此錨定區域連接至黏附區域，以容許第一融合勝肽及第二融合勝肽相互融合。