[發明專利]一種弧菌交叉保護性抗原及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210447901.6
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN102978219A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 胡忠;夏常艷;倫鏡盛;袁傳飛
• 申請（專利權）人: 汕頭大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/28;C12N1/21;A61K39/106;A61P31/04;C07K16/12;G01N33/569;C12R1/63;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

1.一種麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB，其特征在于，該基因具有如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6、SEQ?ID?NO.7或SEQ?ID?NO.8所示的核苷酸序列。

2.一種重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備方法，該方法包括如下步驟：

（1）麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB的克隆；

（2）大腸桿菌表達載體pET32-LamB的構建；

（3）大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB的構建；

（4）重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

（1）麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB的克隆：設計簡并引物，以弧菌的基因組DNA為模板，進行PCR，得到麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB；然后將其連至pMD19-T中，構建大腸桿菌克隆載體pMD19-T-LamB；將該載體轉化至DH5α感受態細胞，構建大腸桿菌重組菌DH5α-pMD19-T-LamB，測序；其中簡并引物序列如下：

LamB-F:5'-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3'

LamB-R:5'-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3'

其中，S=C/G；N=A/C/G/T；Y=C/T；R=A/G；

（2）大腸桿菌表達載體pET32-LamB的構建：設計表達引物，以克隆載體pMD19-T-LamB為模板，進行PCR,將得到的LamB基因與表達載體pET32a(+)用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，連接，構建大腸桿菌表達載體pET32-LamB；其中表達引物序列如下：

LamBeF:5'-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3'

LamBeR:5'-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3'；

（3）大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB的構建：將（2）中的大腸桿菌表達載體pET32-LamB轉化BL21感受態細胞，得到大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB；

（4）重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備：在液體LB（含100μg/ml的氨芐青霉素）培養基中按1%比例接入培養過夜的（3）中的大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB菌液，在37℃培養至OD600=0.6后加入1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，于37℃溫度進行誘導表達6h；收集菌體，純化包涵體，包涵體純化液直接過鎳NTA瓊脂糖凝膠FF柱，親和層析純化重組酶，咪唑梯度競爭洗脫，得到純化的重組麥芽糖孔蛋白LamB。

4.由權利要求2或3所述的方法制備的重組麥芽糖孔蛋白LamB。

5.制備權利要求4所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB的大腸桿菌表達載體pET32-LamB。

6.制備權利要求4所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB的大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB。

7.一種弧菌交叉保護性疫苗，其特征在于，該疫苗含有權利要求4所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB。

8.治療弧菌病的藥物，其特征在于，該藥物含有權利要求4所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB。

9.以權利要求4所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB為免疫原制備的抗體。

10.含有權利要求9所述抗體的用于檢測弧菌病的診斷試劑盒。